臺灣林檎葉片浸提液對致腐微生物的抑制效果

李玉霞， 錢關澤， 李凡海， 劉廷磊， 劉蓮芬

(聊城大學， 山東 聊城 252059)

臺灣林檎葉片浸提液對致腐微生物的抑制效果

李玉霞， 錢關澤*， 李凡海， 劉廷磊， 劉蓮芬

(聊城大學， 山東 聊城 252059)

為臺灣林檎的深入研究及其開發應用提供理論依據，采用生長速率法測定江西和浙江2個地區臺灣林檎葉片浸提液對黑曲霉菌、毛霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。結果表明：除江西臺灣林檎葉片浸提液對毛霉菌沒有抑制效果外，2個地區臺灣林檎浸提液對其他致腐微生物均有抑制作用，其中浙江臺灣林檎葉片浸提液的抑菌效果最佳，對黑曲霉、毛霉菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率分別為93.13%、62.4%、97.88%和100%；江西臺灣林檎葉片浸提液對這4種致腐微生物的抑制率分別為38.7%、-7.48%、99.94%和100%，對毛霉菌的菌絲生長具有促進作用。臺灣林檎浸提液具有抑菌防腐的效果，但在選擇臺灣林檎作為植物源天然防腐劑原料時應注意其來源地，最好進行試驗確定其是否適合作為特定微生物防腐劑的原料。

臺灣林檎； 浸提液； 致腐微生物； 抑菌效果

臺灣林檎〔Malusdoumeri(Bois.)Chev.〕為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus Mill.)落葉喬木[1]。其葉片含有多種物質，如根皮酚、根皮酸、蛋白質、氨基酸、VC、VE、黃酮苷、黃酮類、多酚類、多元酚、甾醇、胡蘿卜苷、白楊素等[2-4]。其中黃酮、酚類、皂苷類等物質具有抑菌、防腐和抗氧化等多種功效，可作為生產生物防腐劑的原料[3，5-6]。目前，國內外對其作為生物防腐劑及作用原理的研究鮮見報道。為此，筆者以浙江和江西2個地區臺灣林檎葉片浸提液為原料，研究其對黑曲霉菌、毛霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄桿菌等4種常見致腐微生物的抑制效果，以期為臺灣林檎的深入研究、開發應用和大面積種植提供理論依據，同時為其后期抑菌防腐效果和抑菌機理的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 臺灣林檎與菌種 臺灣林檎：采集于浙江龍泉昴山和江西井岡山。真菌：黑曲霉菌(Aspergillusniger)和毛霉菌(Mucor)，由發霉食物上分離純化獲得，保存于聊城大學生命科學院微生物重點實驗室。細菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄桿菌(BacillusSubtilis)，來源于聊城大學生命科學院微生物重點實驗室。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：葡萄糖、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、殼聚糖、硝酸銀等。儀器：SW-CJ-IF型單人單面無菌超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司生產；LRH-250A型生化培養箱，金壇市科析儀器有限公司生產；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 臺灣林檎葉片浸提液的制備 分別稱取4 g江西和浙江的臺灣林檎葉片、日瓦海棠葉片粉碎物各2份，分別加入200 mL無菌水。其中，一份煮沸10 min，冷卻后定容至200 mL，靜置24 h后過濾，棄濾渣；另一份浸泡24 h后直接過濾，棄濾渣。分別保存濾液，備用。

1.2.2 殼聚糖-Ag溶液的制備 用有效成分含量為2%的乙酸溶液，配制殼聚糖-Ag溶液(殼聚糖∶硝酸銀為100∶1)備用。

1.2.3 培養基的制備 參照文獻[7-8]的方法，配制pH 7.4～7.6的牛肉膏蛋白胨培養基，121℃高壓濕熱滅菌20 min。參照文獻[9]的方法，配制PDA培養基，分裝后121℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2.4 培養基平板的制備 分別向滅菌后冷卻至50℃左右的24 mL牛肉膏蛋白胨培養基、PDA培養基中加入6 mL臺灣林檎葉片浸提液，充分混勻后分別倒入已滅菌的3個培養皿中，靜置使其冷卻備用。用防腐效果較好的日瓦海棠葉片浸提液和對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果較好的殼聚糖-Ag溶液替換臺灣林檎葉片浸提液作為陽性對照，空白對照加入6 mL無菌水。

1.2.5 致腐微生物的分離與純化 選取無菌水處理后發霉的饅頭、米飯和餅干分別接種到含有PDA培養基的培養皿中，放入(25±1)℃恒溫培養箱中培養，待真菌菌落出現后及時分離到無菌處理的PDA培養基培養皿中培養，待菌落相對純凈后，參照文獻[9]的方法進行單胞分離純化處理，獲得純凈菌落，分別標記后保存于4℃冰箱備用。

1.2.6 致腐微生物的鑒定 查看致腐微生物的菌落形態、顏色及生長速率等；在電子顯微鏡下觀測致腐微生物的菌絲和孢子的形狀、長短、大小、顏色和有無橫隔等形態，參照《真菌鑒定手冊》《普通真菌學》《中國真菌志》等文獻確定分離獲得的真菌種屬。

1.2.7 微生物接種及檢測 真菌接種參照文獻[10-11]的方法，將直徑為0.5 cm的菌餅，長菌的一面朝向培養基，密封、標記后置于(25±1)℃恒溫培養箱中培養，每個處理3次重復，待菌落長至合適大小時參照文獻[12]的方法測定菌落直徑并拍照。細菌接種采用劃線法，用接種環蘸取少量菌種，在培養皿上劃均勻細線，密封、標記后置于(25±1)℃恒溫培養箱中培養，每處理3次重復，待菌落長至合適時期觀測菌落數量并拍照。

1.3 統計分析

試驗數據用軟件Microsoft Excel進行統計、整理，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同處理對致腐真菌的抑制效果

從表1可知，不同處理對2種致腐真菌的抑制效果存在一定差異，浙江臺灣林檎葉片浸提液對黑曲霉的抑制率最高，達93.13%；殼聚糖-Ag溶液的抑制率次之，為42.17%。殼聚糖-Ag溶液對毛霉菌的抑制率最高，達68.32%；浙江臺灣林檎葉片浸提液的抑制率次之，為62.4%。江西臺灣林檎葉片浸提液對毛霉菌的抑制率為-7.48%，說明該浸提液對菌絲生長有促進作用；對黑曲霉菌的抑制效果也較差，抑制率僅38.7%。表明，毛霉菌對4種制劑的抵抗能力較強，在防治腐敗變質時可采用其他方法或增加制劑濃度等達到預期效果；浙江臺灣林檎葉片浸提液抑制真菌生長、預防發霉變質的效果明顯，具有作為天然植物防腐劑的潛力。選擇江西臺灣林檎葉片浸提液作為天然植物防腐劑時最好進行試驗，以確定是否可作為特定微生物的防腐劑。

表1 不同處理對2種致腐真菌的抑制率

2.2 不同處理對致腐細菌的抑制效果

從表2看出，臺灣林檎葉片浸提液和殼聚糖-Ag溶液對2種致腐細菌的抑制效果較好，其中，浙江、江西臺灣林檎葉片浸提液對大腸桿菌的抑制率分別為97.88%和99.94%，對金黃色葡萄球菌的抑制率均為100%；殼聚糖-Ag溶液對2種致腐細菌的抑制率均為100%。日瓦海棠葉片浸提液不能抑制2種致腐細菌的生長，反而會促進大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長，抑制率分別為-134.73%和-291.46%。臺灣林檎葉片浸提液和殼聚糖-Ag溶液對2種致腐細菌的抑制率差異較小，但均與日瓦海棠葉片浸提液的抑制率存在明顯差異。表明，浙江和江西2個地區的臺灣林檎葉片浸提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制功效相當，并可完全滅殺金黃色葡萄球菌，臺灣林檎葉片浸提液在抑制致腐細菌生長、預防發霉變質方面效果明顯，具有作為天然植物防腐劑的潛力。

表2 不同處理對2種致腐細菌的抑制率

3 結論與討論

試驗結果表明，浙江、江西臺灣林檎葉片浸提液對黑曲霉的抑制率分別為93.13%和38.7%，對毛霉菌的抑制率分別為62.40%和-7.48%；對大腸桿菌的抑制率分別為97.88%和99.94%，對金黃色葡萄球菌的抑制率均為100%。表明，除江西臺灣林檎葉片浸提液對對毛霉菌沒有抑制效果外，浙江、江西臺灣林檎葉片浸提液對其他真菌和細菌的抑制效果較好，對致腐細菌的抑制效果優于致腐真菌，具有作為天然防腐劑的潛力。不同地區的臺灣林檎葉片浸提液對同一種微生物的抑制效果不同，同一地區臺灣林檎葉片浸提液對不同微生物的抑制效果也不同。原因可能是臺灣林檎葉片內的一些物質受到生長環境條件影響，成分發生變化，因此在選擇臺灣林檎作為植物源天然防腐劑原料時應注意其來源地，最好進行試驗確定其是否適合作為特定微生物的防腐劑原料。

鄧芳席等[13]研究表明，林檎葉浸出物對部分真菌和細菌有抑制作用，可顯著抑制金黃色葡萄球菌(BacillusSubtilis)、枯草桿菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(As.flavus)、青霉(PenicilliumSP)等致腐微生物的生長，對豬肉、茄子和豆腐等食品具有一定的防腐效果；黃衛文等[14]研究林檎葉提取物對小白鼠體內的抑菌效果，結果表明，溫水浸出物和乙醇提取物具有顯著的抑菌效果，主要抗菌成分為有機酸、單寧、皂苷。本研究結果與前人的研究結果相符合，但不同區域臺灣林檎浸提液的抑菌效果差異前人研究中未涉及，至于是否只是單純的生長環境影響或不同生長地區是否會造成其他影響，這些影響是否可以遺傳也有待進一步研究。浙江和江西2個地區的臺灣林檎葉片浸提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制功效相當，但是否為同一種或一類物質發生作用，還需要進一步研究證實。在供試濃度下，2種浸提液可以完全滅殺金黃色葡萄球菌，對大腸桿菌的作用主要是抑制其生長，不能完全殺滅，是否提升其供試濃度可完全殺滅，還有待進一步研究。

[1] 李玉霞，錢關澤，李凡海.臺灣林檎研究進展[J].農業科技與裝備，2015(7):27-29.

[2] 謝達平，趙肅青，曾曉雄，等.尖嘴林檎葉防霉有效成分分析[J].林產化學與工業，1998，18(2):33-38.

[3] 盧 靜，楊豐慶，夏之寧.尖嘴林檎葉的化學成分[J].中成藥，2014，36(8):1692-1696.

[4] 林葉新，李忠海.林檎葉水提物及其不同極性組分的抑菌和清除自由基作用的研究[J].天然產物研究與開發，2012(9):1264-1269，1287.

[5] 文 潔，周法興.臺灣林檎葉化學成分研究[J].中藥材，1998，21(11):572.

[6] 林葉新，李忠海.林檎葉防腐保鮮成分微波提取工藝的優化研究[J].化工技術與開發，2012，41(3):13-17.

[7] Li X D，Lei G，Juan Z，et al.Optimisation for high cell density cultivation of Lactobacillus salivarius BBE 09-18 with response surface methodology[J].International Dairy Journal，2013，23(7):1-7.

[8] Lee K B，Kim H J，Lee E J.Mixed cultures of kimchi lactic acid bacteria show increased cell density and lactate productivity[J].African Journal of Biotechnology，2013，12(25)：4000-4005.

[9] 李凡海.康寧霉素對臭椿苗期病害致病菌抑菌機理的研究[D].聊城：聊城大學，2015.

[10] 李凡海，王桂青.辛夷六種溶劑平行提取物對黃瓜灰霉病菌的抑制作用[J].北方園藝，2015(2):108-111.

[11] 畢旺華，李建杰，周魯寧.殼聚糖對真姬菌絲體生長的影響[J].北方園藝，2015(1):142-144.

[12] 李凡海，王桂青.細辛精油和3種化學農藥對茄子枯萎病菌的抑制作用[J].農業科技與裝備，2015，241(7):10-13.

[13] 鄧芳席，黃祖法.林檎葉抑菌作用的研究[J].食品科學，1996，17(3):47-50.

[14] 黃衛文，鐘海雁，魏元青.林檎葉中有效成分在小白鼠體內的抑菌作用[J].中南林學院學報，2001，21(5):54-57.

(責任編輯： 馮 衛)

Inhibitory Effect ofMalusdoumeriLeaves’ Extract Liquid on Spoilage Microorganism

LI Yuxia, QIAN Guanze*, LI Fanhai, LIU Tinglei， LIU Lianfen

(LiaochengUniversity,Liaocheng,Shandong252059,China)

The inhibitory effect ofM.doumerileaves’ extract liquids from Jiangxi and Zhejiang Province onAspergilusniger,M.doumeri,EscherichiacoliandStaphylococcusaureuswas determined by the growth rate method to provide the theoretical basis for development and application ofM.doumeri. Results: Except that theM.doumerileaves’ extract liquid from Jiangxi Province has no inhibitory effect onMucormucedo,M.doumerileaves’ extract liquids from Jiangxi and Zhejiang Province have the inhibitory effect on other spoilage microorganism. TheM.doumerileaves’ extract liquid from Zhejiang Province has the better inhibitory effect. The inhibitory rate ofM.doumerileaves’ extract liquid from Zhejiang Province onAspergilusniger,Mucormucedo,EscherichiacoliandStaphylococcusaureusis 93.13%, 62.4%, 97.88% and 100% respectively. The inhibitory rate ofM.doumerileaves’ extract liquid from jiangxi Province onAspergilusniger,Mucormucedo,EscherichiacoliandStaphylococcusaureusis 38.7%, -7.48%, 99.94% and 100% separately and has the promotion effect on mycelial growth ofMucormucedo.The extract liquid ofM.doumerihas the bacteriostasis and antiseptic effect but the essential test should be conducted whenM.doumeriis selected as a raw material of natural botanical preservatives against the specific microorganism.

Malusdoumeri; extract liquid; spoilage microorganism; inhibitory effect

2016-03-16； 2016-03-31修回

國家自然科學基金資助項目“蘋果屬(薔薇科)植物雜交起源研究(31070619)”，“蘋果屬(薔薇科)植物分類修訂”(31170178)

李玉霞(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：植物分類學。E-mail：1066211648@qq.com

*通訊作者：錢關澤(1965-)，男，教授，博士，碩士生導師，從事種子植物分類研究。E-mail：qianguanze@lcu.edu.cn

1001-3601(2016)05-0207-0081-03

S685.12

A