青貯玉米優良乳酸菌的分離與篩選

席琳喬， 吳書奇， 史卉玲， 劉 慧， 馬春暉

(1. 塔里木大學 動物科學學院/兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300； 2.新疆生產建設兵團 第一師十二團畜牧獸醫工作站， 新疆 阿拉爾 843300； 3.石河子大學 動物科學技術學院， 新疆 石河子 832000)

青貯玉米優良乳酸菌的分離與篩選

席琳喬1， 吳書奇1， 史卉玲2， 劉 慧1， 馬春暉3*

(1. 塔里木大學 動物科學學院/兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300； 2.新疆生產建設兵團 第一師十二團畜牧獸醫工作站， 新疆 阿拉爾 843300； 3.石河子大學 動物科學技術學院， 新疆 石河子 832000)

為改善和提高青貯飼料的品質提供優良菌種，采用MRS平板分離、生理生化分析和16S rDNA鑒定相結合的方法對新疆阿克蘇地區青貯玉米(ZeamaysL.)中乳酸菌的種類、形態學及生理生化特性進行研究。結果表明：從青貯玉米分離到10個菌株，其中，2株為地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenniformis)，2株為面包乳桿菌(Lactobacilluscrustorum)，4株為鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)，2株為干酪乳桿菌(L.casei)，均為異型乳酸菌。地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)在pH 3.0～3.5能生長，其他菌不生長或者生長較弱，但在pH 4.0～8.0均能生長；10個菌株均可在6.5%和8.0% NaCl條件下生長；地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)的生長速度快、產酸性能好，可作為制作青貯飼料的優良菌株。

青貯玉米； 乳酸菌； 分離； 鑒定； 新疆

青貯飼料發酵是一個復雜的過程，為提高青貯穩定性，越來越多的添加劑被應用于青貯飼料。目前應用最多的添加劑是乳酸菌[1]，乳酸菌是一類能利用可發酵碳水化合物發酵產生乳酸的厭氧菌或微需氧菌的總稱，是促使秸稈飼料發酵的主要有益微生物[2]。在飼料青貯發酵中起作用的乳酸菌約20多種[3]，可以分成同型乳酸菌和異型乳酸菌。越來越多的研究表明，同型發酵乳酸菌和異型發酵乳酸菌同時作用，更有利于青貯飼料營養成分的保存和有氧條件下的穩定[4-5]。也有很多研究表明，同型發酵乳酸菌能加速青貯飼料的腐敗變質[6-7]。劉晗璐[3]從禾本科牧草篩選的一株蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtti)，同時指出腸球菌屬(Enterococcus)糞腸球菌(E.faecalis)較適合做青貯啟動菌株的菌種。王小芬等[8]率先從苜蓿中篩選出對苜蓿發酵有顯著促進效果的乳酸菌復合系AL2，并從青貯苜蓿中分離出一株戊糖乳桿菌(L.pentosus)。熱娜·米吉提[9]研究發現，布氏乳桿菌CF10所產類細菌素Lactobacillin FC-10在酸性條件下穩定且活性高，對革蘭氏陰性菌、酵母菌和真菌有明顯的抑制作用。葛紅蓮等[10]從乳酸桿菌中分離得1種廣譜的微生物化合物，對G+菌、G-菌以及真菌都有抑菌活性。張滿昌[11]研究了快速氨化、微貯玉米秸稈對綿羊瘤胃發酵及生長性能的影響。

青貯玉米(ZeamaysL.)產量高、機械化程度高，可長期保存和均衡供應，是解決草食動物規模化飼養所需粗飼料的有效途徑之一[12]，青貯玉米和玉米秸稈的低水分青貯得到廣泛應用，深受農牧民喜歡。由于新疆南疆地區夏季氣溫高，紫外線強，植物表面附著特殊的乳酸菌，加之青貯飼料的含水量高，青貯品質差，二次發酵現象嚴重，導致嚴重浪費[13-14]。因此，分離篩選優質的乳酸菌對提高青貯品質尤為重要。為此，筆者通過對阿克蘇地區青貯玉米的乳酸菌進行分離、篩選，以期為改善和提高青貯飼料的質量提供優良菌種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青貯飼料為采自新疆阿克蘇地區第一師五團牛場、十團牛場和十二團牛場的青貯玉米。

10×Buffer(sigma公司)，2.5 mmol/L dNTP Mixture (sigma公司)，X-gal，IPTG，蛋白酶K，過硫酸銨，丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，尿素，去離子甲酰胺(sigma公司)；T4連接盒，5 U/μL Taq酶，細菌提取試劑盒，質粒小提試劑盒，大腸桿菌(DH5α)來自新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。細菌基因組提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒(Bioteke corporation)；瓊脂糖；氨芐青霉素、溶菌酶、蛋白酶K(Takara 公司)；M1200，DL2000 (西安沃爾森公司)；引物8f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492r：5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’(華大基因合成)；TIANamp Bacteria DNA Kit(天根生化科技有限公司)。

1.2 乳酸菌的分離與篩選

1) 分離。稱取10 g青貯飼料樣品放入液體MRS培養基，室溫發酵24 h，吸取1 mL上清液加入到9 mL無菌水中，漩渦震蕩，以此稀釋成10-3、10-4和10-53個梯度，分別吸取3個梯度的菌液50 μL涂布于固體MRS平板培養基上，37 ℃培養48～72 h，挑取單菌落，分離純化3次后保存[15-16]。

2) 測定生長曲線。將OD值為0.5的乳酸菌菌液以6.0%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養。每隔2 h測其OD值，波長600 nm，測定時間為12～24 h[17]。

3) pH測定。將OD值為0.5的乳酸菌菌懸液以10%的接種量接種到pH 6.5的MRS液體培養基中，培養溫度37 ℃，培養時間24 h。

4) 生長條件試驗。將OD值為0.5的菌液分別接種于以下處理的MRS液體培養基中，培養48 h，測定OD值。溫度為5℃、10℃、40℃和45℃；pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、7.0和8.0(26℃)；鹽濃度為6.5%、8.0%(26℃)。

5) 產酸速率測定。每隔2 h測定發酵液pH，培養溫度為37 ℃，培養時間為12 h。

1.3 乳酸菌的鑒定

1.3.1 生化鑒定 對純化后菌株活化24 h，進行革蘭氏染色，觀察菌落的顏色、形態及大小等。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》進行乳酸菌生理生化特性鑒定[18]。

1.3.2 分子生物學鑒定 PCR擴增乳酸菌16S rDNA基因序列，擴增引物為27 f和1492 r。PCR、電泳、染色。用PCR儀對各個菌株的DNA進行擴增，所使用擴增反應的體系為20 μL，體系如下：5 μL 10×Buffer，1 μL dNTP Mixture，0.50 μL Taq酶，1 μL DNA模板，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，無菌超純水補足至20 μL后進行PCR擴增反應。反應條件：95℃，3 min；94℃，1 min；53℃，1 min；72℃延伸90 s，30個循環，72℃延伸8 min，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增的PCR產物進行檢測。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌篩選

從圖1可見，從青貯玉米中篩選出乳酸菌10株，其在24 h內均可將MRS液體培養基pH從6.5降至4.2以下，產酸能力較強。其中，Q1和Q2的產酸能力最強，pH降至3.8；M4和Q4的產酸能力最弱，pH降至4.2。各菌株產酸能力的強弱依次為Q1、Q2、Q7、Q9、Q10、Q11、Q4、M2、L、Q4和M4。

圖1 試驗篩選出的10株乳酸菌株的產酸能力

Fig.1 Acid-producing ability of 10 identified lactic acid bacterium strains

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性 從圖2可見：1) 產酸速率。菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10和Q11的產酸能力強。其中，0～6 h時產酸速率較快，6～12 h時產酸速率變化平緩，在12 h之內菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10和Q11的pH均降至4.2以下，能快速產生酸，降低pH；在0～12 h時菌株M2、M4和L的產酸速率較慢，Q2在4～6 h時產酸速率最快。2)生長曲線。菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10和Q11在0～8 h時生長最快，在8～12 h時生長速度較慢；整體上，菌株M4和M2的生長較慢，M4在4～8 h時生長速度較快，M2在4～10 h時生長速度較快。

圖2 試驗篩選出的10株乳酸菌株的產酸速率和生長曲線

Fig.2 Acid-producing rate and growth curve of 10 identified lactic acid bacterium strains

從表可見，所有乳酸菌菌株均為革蘭氏陽性菌，觸酶均為陰性，且不產硫化氫。菌株在5～45℃、pH 4.0～8.0均能生長；菌株Q1在pH 3.0～3.5能生長，其他菌不生長或者生長較弱。試驗篩選出的10株乳酸菌株均可在6.5%和8.0% NaCl條件下生長。

2.2.2 分子生物學鑒定 提取乳酸菌的基因組DNA后，采用細菌通用引物對其16S rDNA序列擴增，片段大小為1 500 bp左右(圖3)。測序獲得的16S rDNA序列通過BLAST與GenBank數據庫中已知序列進行比對分析發現，菌株Q7、Q9、Q10和Q11與編號AB288235的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)序列同源性達99%；菌株M2、M4與編號HQ259722的干酪乳桿菌(L.casei)序列同源性達98%，菌株Q4和L與編號AM285451的面包乳桿菌(L.crustorum)序列同源性達99%；菌株Q1和Q2與編號JN366760的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenniformis)序列同源性達99%。

表 試驗篩選出的10株乳酸菌株的生理生化特性

注：+，表示陽性；-，表示陰性反應。

Note: +,positive;-, negative.

注：M為DL2000; 1～10分別為菌株Q1, Q2, Q4, Q7, Q9, Q10, Q11, M2, M4和L。

Note: M, DL2000; 1～10, Q1, Q2, Q4, Q7, Q9, Q10, Q11, M2, M4 and L strain respectively.

圖3 試驗篩選出的10株乳酸菌株的16S rDNA擴增圖譜

Fig.3 16S rDNA amplification of 10 identified lactic acid bacterium strains

3 結論與討論

阿克蘇地區青貯玉米中的優良乳酸菌主要為地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)、面包乳桿菌(L.crustorum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)和干酪乳桿菌(L.casei)。其中，地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)生長速度快，pH下降能力強，可以作為制作青貯飼料乳酸菌的優良菌株。

有關研究表明，青貯原料中活性乳酸菌至少為1×105cfu/g·個才能保證制作良好的青貯飼料[19]。該試驗分離到菌株Q1和Q2為地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)，與張慧杰等[20]分離的菌株相同，該菌株可以產生纖維素降解酶，有利于青貯發酵過程中纖維素的降解；菌株Q4和L為面包乳桿菌(L.crustorum)；菌株Q2、Q7、Q9、Q10和Q11為鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)，而在青貯料中篩選出該菌的報道較少。王佳[21]從益生4乳制品中分離出鼠李糖乳桿菌，該菌產生L-型乳酸在青貯飼料生產中發揮著重要作用；菌株M2和M4為干酪乳桿菌(L.casei)，與劉飛[1]從青貯料中分離到的菌株相同。后期將對該菌株的發酵條件進行進一步研究。

[1] 劉 飛.青貯飼料中優良乳酸菌的分離鑒定及其應用[D].哈爾濱：東北農業大學，2005.

[2] 張 剛.乳酸細菌—基礎技術和應用[M].北京：化學工業出版社，2007.

[3] 劉晗璐.禾本科牧草乳酸菌發現及發酵品質檢測與動物生產性能影響研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2008.

[4] Haigh P M,Parker J W G. Effect of silage additives and wilting on silage fermentation, digestibility and intake,and on liveweight change of young cattle[J].Grass and Forage Science,1985,40:429-436.

[5] Ranjit N K,Taylor C C,Kung Jr L.Effect of lactobacillus buchneri 40788 on the fermentation,aerobic stability and nutritive value of maize silage[J].Grass and forage sci.，2002,57:73-81.

[6] Filya I，Sucu E，Karabulut A.The effect of Lactobacillus buchneri on the fermentation，aerobic stability and ruminal degradability of maize silage[J].Journal of Applied Microbiology，2006，101：1216-1223.

[7] Kleinschmit D H,Kung L.The effects of lactobacillus buchneri 40788 and pediococcus pentosaceus R1094 on the fermentation of corn silage[J].J.dairy sci.，2006,89:3999-4004.

[8] 王小芬，高麗娟，楊洪巖，等.苜蓿青貯過程中乳酸菌復合系Al2的接種效果及菌群的追蹤[J].農業工程學報，2007(1)：217-222.

[9] 熱娜·米吉提.新疆飼料乳酸菌分離鑒定及多樣性分析[D].烏魯木齊：新疆大學，2012.

[10] 葛紅蓮，郭翠紅，張軍令.兩株乳酸菌的分離鑒定及產酸性能的研究[J].周口師范學院學報，2009，26(2):89-90.

[11] 張滿昌.快速氨化、微貯玉米秸稈對綿羊瘤胃發酵及生長性能的影響[D].哈爾濱：東北農業大學，2005.

[12] 林 紅，何晶麗.玉米在畜牧養殖業中的有效利用[J].黑龍江農業科學，2014(7)：77-79.

[13] 韓吉雨.青貯發酵體系中乳酸菌多樣性的研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2009.

[14] 花 梅.不同地區青貯玉米發酵特性及微生物多樣性[D].北京：中國農業科學院，2013.

[15] 凌代文，東秀珠.乳酸菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業出版社，1999：82-125.

[16] 魏日華，桂 榮，塔 娜.牧草中異型發酵乳酸菌的分離與鑒定[J].草業科學，2010(10)：149-153.

[17] 錢存柔，黃儀秀.微生物學實驗指導[M].北京：北京大學出版社，1999.

[18] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[19] 趙子夫.乳酸菌的分離篩選及其對玉米青貯品質和有氧穩定性的影響[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2009.

[20] 張慧杰，玉 柱，王 林，等.青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優良菌株的篩選[J].草地學報，2011，19(1)：137-141.

[21] 王 佳.鼠李糖乳桿菌與干酪乳桿菌發酵大豆乳工藝研究[D].保定：河北農業大學，2009.

(責任編輯： 王 海)

Solation and Identification of Good Lactic Acid Bacteria from Silage Maize

XI Linqiao1, WU Shuqi1, SHUI Huiling2, LIU Hui1, MA Chunhui3*

(1.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity/TarimKeyLaboratoryofAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300; 2.StationofAnimalHusbandryandVeterinary, 12thRegiment,theFirstDivision,XinjiangProductionandConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China)

The lactic acid bacteria strains were isolated from silage maize in Akesu Prefecture, Xinjiang by MRS plate method and the isolated strains were identified by determining the physiological-biochemical indexes and 16S rDNA method to discuss species, morphology and physiological-biochemical property of lactic acid bacteria in silage maize and provide good strains for improvement of silage quality. Results: 10 strains are successfully isolated from silage maize and they all are heteromorphosis lactic acid bacteria including 2Bacilluslichenniformisstrains, 2Lactobacilluscrustorumstrains, 4L.rhamnosusstrains and 2L.caseistrains. 2Bacilluslichenniformisstrains can grow at pH 3.0～3.5 and other strains can not grow or grow weakly at pH 3.0～3.5 but 10 strains all can grow at pH 4.0～8.0. 10 strains all can grow under the conditions of 6.5% NaCl and 8.0% NaCl.B.lichenniformisstrains with fast growth rate and good acid-producing performance can be used as good strains in additive for silage by determining its lactic acid bacteria growth curve and acid-producing velocity.

silage maize; lactic acid bacteria; isolation; identification; Xinjiang

2015-04-22； 2016-02-13修回

農業部國家牧草產業體系綜合試驗站項目(CARS35-44)；兵團畜牧科技重點實驗室開放課題“暴露時間對袋裝玉米青貯產氣消長機理研究”(HS201404)

席琳喬(1978-)，男，副教授，博士，從事飼料資源開發與利用。E-mail: gsxlq666@163.com

*通訊作者：馬春暉(1966-)，男，教授，博士，從事飼料資源開發與利用。E-mail: chunhuima@126.com

1001-3601(2016)03-0123-0102-04

S816.53

A