貴州不同產地苦參生物總堿和總黃酮的含量比較

陸平祝， 龍慶德， 常楚瑞， 彭建端， 金 燕， 王曉麗

(貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004)

貴州不同產地苦參生物總堿和總黃酮的含量比較

陸平祝， 龍慶德， 常楚瑞*， 彭建端， 金 燕， 王曉麗

(貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004)

為黔產苦參資源的保護利用提供依據，采用紫外分光光度法對貴州不同產地苦參的生物總堿和總黃酮的含量進行研究。結果表明：不同產地苦參有效成分含量的差異較大。其中，以畢節市大方縣和銅仁市思南縣的苦參生物堿含量最高，分別達15.6%和15.2%，明顯高于其他產地的苦參；六盤水市老鷹山的苦參總黃酮含量最高，為15.7%。

苦參； 生物總堿； 總黃酮； 紫外分光光度法； 貴州

苦參(Sophoraflavescensvar.flavescens)為豆科槐屬植物[1]，落葉亞灌木，10月掘取根部，干燥入藥；常見于沙地、山坡、灌叢和草地，全國各地廣泛分布，現貴州多地有野生種和栽培種。其干燥根始載于《神農本草經》，主要化學成分為喹嗪啶類生物堿和異戊烯基黃酮類[2-3]，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效。目前，國內外對苦參的研究主要側重于苦參藥材及其復方制劑在抗腫瘤、抗病毒和抗感染等以及其質量評價方面，并已形成婦科洗液、苦參針劑和苦參注射液等醫藥制劑[4-8]。隨著苦參用途的不斷增加，苦參原料的用量逐年增長[9]。苦參藥材生物總堿和總黃酮的含量與生長環境有密切關系[10]。為此，筆者于2015年對貴州不同產地苦參的生物總堿和總黃酮的含量進行比較研究，以期為保護野生苦參資源，尋找適合苦參種植的基地，為貴州苦參種植產業的發展及其資源綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 苦參藥材 采挖于貴州省21個不同區域(表1)。經貴州醫科大學藥用植物學與生藥學教研室鑒定為苦參(S.flavercensAit.)的根。

1.1.2 試劑 苦參堿標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110780-201007110805-200508)，蘆丁標準品(上海源葉生物科技有限公司，批號:Y05M6S1)，溴麝香草酚藍磷酸氫二鈉緩沖溶液，蘆丁、濃氨、三氯甲烷、醋酸鉀(KAC)和乙醇，均為分析純。

1.1.3 儀器與設備 METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，AS系列超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司，250 W，100 kHZ)，Q-250B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)，UV-5800PC型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)，HH-Z數顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)，DROGON移液槍(上海恒奇儀器有限公司)。

1.2 材料預處理

1.2.1 標準溶液的制備 精密取苦參堿標準品5 mg，加入25 mL容量瓶中，加無水乙醇25 mL，制成0.2 g/L的苦參堿標準溶液；取蘆丁標準品5 mg，用 60%乙醇超聲溶解并定容至25 mL，得濃度為0.2 g/L的蘆丁標準溶液。

表1 貴州不同產地苦參材料的來源

Table 1 The source ofS.flaescensfrom different regions in Guizhou

編號No．產地Site緯度E/°Latitude經度N/°Longitude1銅仁市德江縣N28°15′E108°05′2貴陽市龍洞堡N26°34′E106°46′3修文縣扎佐鎮N26°51′E106°42′4凱里市香爐山N26°36′E107°53′5麻江縣下司鎮N26°36′E107°58′6遵義市余慶縣N27°13′E107°53′7貴陽市二戈寨N26°30′E106°43′8貴陽市世紀城N26°36′E106°37′9貴陽市水田鎮N26°44′E106°49′10興仁縣百德鎮N25°41′E105°26′11開陽縣南江鄉N26°56′E106°58′12清鎮市百花湖N26°41′E106°31′13花溪區孟關鄉N26°24′E106°44′14黔南州龍里縣N26°27′E106°58′15貴陽市大轉彎N26°49′E106°12′16六盤水老鷹山N26°33′E105°01′17畢節市大方縣N27°08′E105°36′18安順市平壩縣N26°24′E106°16′19銅仁市思南縣N27°40′E107°59′20貴陽市花溪區N26°23′E106°37′21黎平縣高屯鎮N26°20′E109°09′

1.2.2 苦參生物總堿提取 參照文獻[12-13]的方法提取。將貴州不同產地的苦參干燥根粉碎，過3號篩(60目)，精密稱取約0.3 g加入具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液0.5 mL，然后加入三氯甲烷20 mL，塞上塞子，稱重并記錄，超聲波處理30 min，功率250 W，頻率33 kHz，待冷卻至室溫，稱其重量，再用三氯甲烷補足失重，搖勻，過濾，放入冰箱保存待用。

1.2.3 苦參總黃酮的提取 稱取1 g苦參根粉末，采用80%的乙醇約25.5 mL(固液比為1∶25)，超聲處理60 min，功率100 W，待冷卻至室溫，離心，取上清液，用80%乙醇定容至25 mL，搖勻即得。

1.3 最大波長的選擇

1.3.1 苦參生物總堿 微量加樣槍吸取苦參堿標準溶液100 μL分別加入25 mL具塞試管中，水浴蒸干溶液后，加入溴麝香草酚藍磷酸氫二鈉緩沖溶液6 mL(pH 7.6) ，再精密加入三氯甲烷6 mL，塞上塞子劇烈振搖2 min，放置30 min，使水層和三氯甲烷層完全分層，棄上清液；以溴麝香草酚藍磷酸氫二鈉緩沖溶液6 mL+三氯甲烷6 mL為對照(CK)。采用紫外分光光度計在200～800 nm進行掃描，選擇標準品溶液呈最大吸收值的波長作為含量測定波長。

1.3.2 苦參總黃酮 參照文獻[14-17]的方法測定。精密吸取4 mL蘆丁標準溶液置于50 mL容量瓶中，先后加入4.0 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和5.0 mL 1.0 mol/L KAc 溶液，再加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置40 min；以4.0 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和5.0 mL 1.0 mol/L KAc 為空白對照(CK)。采用紫外分光光度計在200～800 nm波長進行掃描，選擇標準品溶液呈最大吸收值的波長作為含量測定波長。

1.4 苦參生物總堿與總黃酮含量的測定

1.4.1 線性關系考察 1) 苦參生物總堿。用微量進樣器精密吸取苦參堿標準液0 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL和300 μL分別加入25 mL具塞試管中，用1.3.1方法測定其吸光度，求出苦參總堿濃度(y1)與吸光度(x1)關系曲線的回歸方程。2) 苦參總黃酮。精密吸取蘆丁標準液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL分別置于50 mL 容量瓶中，用1.3.2方法測定其吸光度，求出苦參總黃酮含量(y2)與吸光度(x2)關系曲線的回歸方程。并以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線見圖2。

1.4.2 精密度試驗 分別取苦參堿標準液100 μL加到5個25 mL具塞試管中，用1.3.1方法測定其吸光度，5次重復；取蘆丁標準品溶液4 mL，用1.3.2方法測定其吸光度，6次重復。

1.4.3 重復性試驗 稱量0.3 g苦參粉末，共6份，用1.2.2方法提取苦參生物總堿，用1.3.1方法測定其吸光度。稱量1 g苦參粉末，共6份，用1.2.3方法提取苦參生物總堿，用1.3.2方法測定其吸光度。

1.4.4 穩定性試驗 分別吸取苦參生物總堿、總黃酮供試品溶液，每隔30 min測定1次，持續4 h；精密吸取苦參總黃酮一供試品溶液，每隔30 min測定1次，持續3 h。

1.4.5 加樣回收率試驗 分別稱取已知含量的苦參總堿和苦參總黃酮提取物各9份，約0.3 g和1 g，分別加入標準品適量。用1.3.1和1.3.2的方法進行測定其吸光度，計算其含量及回收率。

2 結果與分析

2.1 苦參生物總堿和總黃酮含量與吸光度的相關性及波長測定

從圖1可知，根據試驗結果擬合得到苦參總堿含量(y1)與吸光度(x1)在2.55～6.8 μg/mL存在良好的線性關系，其回歸方程為y1=0.094 7x1-0.001 8，相關系數R2=0.999 8；苦參總黃酮含量(y2)與吸光度(x2)在8～24 μg/mL存在良好的線性關系，其回歸方程為y2=0.029 0x2-0.009 4，R2=0.999 1。

從圖2可知，苦參生物總堿最大吸收值對應的波長為413 nm，苦參總黃酮最大吸收值對應的波長為420 nm，因此，分別選擇413 nm和510 nm作為苦參生物總堿和苦參總黃酮含量的測定波長。

2.2 回收率與精密度

經測定：苦參生物總堿標準液的相對標準偏差RSD精密度=0.68%，蘆丁標準液的RSD精密度=0.76%。苦參藥材生物總堿的平均含量為0.36%，RSD重復性=0.62%；其總黃酮平均含量為4.66%，RSD重復性=0.80%。苦參藥材生物總堿和苦參總黃酮的平均含量穩定，其提取液的平均含量分別為4.09%(4 h內，RSD穩定性=1.0%)和4.98%(3 h內，RSD穩定性=1.38%)。從表2可知：苦參生物總堿提取物的加樣回收率在95.68%～99.28%，平均為97.23%，RSD=1.10%；總黃酮的加樣回收率在95.41%～99.24%，平均為96.50%，RSD=1.16%。說明，回收率符合含量測定要求。

圖1 苦參總堿和蘆丁的標準曲線

Fig.1 Matrine standard curve and rutin Standard curve

圖2 苦參堿和蘆丁標準品的吸收光譜

Fig.2 Reference substance wavelength scanning matrine and rutin

表2 苦參藥材提取物的加樣回收率

注：*表示苦參總黃酮的樣品中含量、標準品加入量和測得量的單位為mg。

Note: * represented the content of sophora alkaloids in sample. Unit for adding amount of standard substance and measured value was mg.

2.3 貴州不同產地苦參生物總堿和總黃酮的含量

從表3可知，21個產地的苦參生物總堿和總黃酮含量差別較大。產于畢節市大方縣和銅仁思南縣苦參干燥根的生物總堿含量分別為15.6%和15.2%，明顯高于其他產地；六盤水市苦參干燥根的生物總堿含量最低，為1.58%，但其苦參總黃酮含量最高，為15.7%。建議苦參藥材培育基地的選擇可根據自身需求定。

表3 貴州不同產地苦參的生物總堿和總黃酮含量

3 結論與討論

利用紫外分光度法測定苦參藥材生物總堿和總黃酮含量的方法簡單、可靠。試驗結果表明，不同產地黔產苦參有效成分含量的差異較大，其中，以畢節市大方縣和銅仁市思南縣的苦參生物堿含量最高，分別達15.6%和15.2%，明顯高于其他產地的苦參；六盤水市老鷹山的苦參總黃酮含量最高，為15.7%。

目前，貴州多地有野生苦參和栽培品，該試驗較全面地反映不同產地黔產苦參生物總堿和總黃酮的含量狀況存在較大差異。說明，黔產苦參生物總堿和總黃酮含量的區域性較強。近幾年，苦參原藥的需求逐步增大，因此，應選擇適宜苦參種植區域栽培以提高產量。如何確定苦參藥材的藥源基地，有待于進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版(一部)[M].北京:化學工業出版社，2010:188.

[2] 張 翅，馬 悅，高慧敏，等.苦參化學成分研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2014,20(4):205-214.

[3] 趙 平，張穎君，山本浩文，等.苦參異戊烯基黃酮類化合物的化學，活性及其生物合成研究進展[J].天然產物研究與開發，2004,16(2):172-178.

[4] 付佃華，付亞杰，張棟棟.苦參堿在婦科疾病方面的實驗及臨床研究進展[J].基層醫學論壇，2015,19(4):551-552.

[5] 彭向前，張文會，李 軍.氧化苦參堿和拉米夫定體外抗乙肝病毒的作用[J].中國生化藥物雜志，2012,33(2):142-144.

[6] 任衍菊，張玉萍，金 敏，等.氧化苦參堿體外抗乙型肝炎病毒作用[J].中國實驗方劑學雜志，2012,7(18):175-179.

[7] 劉 欣，索智敏.苦參抗乙肝病毒的作用機制研究[J].中國生化藥物雜，2015(35):67-69.

[8] 陳曉峽，向小慶，葉 紅.苦參堿及氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2013,19(11):361-364.

[9] 劉 濤，王 羅，吳南軒，等.苦參提取物質質量標準研究[J].成都大學學報，2014,33(3)：197-199.

[10] 劉龍元，潘海運，李書淵，等.苦參異地栽培對其生長與氧化苦參堿含量的影響[J].中藥材，2013(10):1569-1572.

[11] 付起鳳，曹 琦，呂邵娃，等.正交法優化苦參中苦參生物堿的超聲提取工藝[J].中醫藥信息，2015,32(1):11-13.

[12] 那 娜，紀麗麗.超聲波法提取苦參總堿的研究[J].黑龍江科學，2012,3(1):9-11.

[13] 鐘彩娜，鐘 文，伍嚴利.正交實驗優選苦參生物堿的提取工藝[J].醫學信息臨床醫學，2011,24(9):6038-6039.

[14] 高紅寧，殷 奕.苦參藥材中氧化苦參堿和苦參總黃酮含量比較[J].中國實驗方劑學雜志，2013,19(17):66-69.

[15] 鄭津輝，王 威，黃 輝.苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用[J].武漢大學學報：理學版，2008,54(4):439-442.

[16] 李 艷，張麗艷，楊玉琴，等.黔產苗藥石吊蘭黃酮類成分含量對比研究[J].中國現代中藥，2011,13(3)：11-13.

[17] 馬鴻雁，周婉珊，褚夫江，等.苦參中黃酮類成分的高效液相指紋圖譜及5種成分的含量測定[J].中國中藥雜志，2013,38(16):2690-2695.

(責任編輯： 王 海)

Comparative Study on Contents ofSophoraAlkaloids and Flavonoids from Different Habitats of Guizhou

LU Pingzhu, LONG Qingde， CHANG Churui*, PENG Jianduan, JIN Yan, WANG Xiaoli

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

To provide basis for protection and utilization ofS.flavescensresources in Guizhou, UV spectrophotometry was employed to analyze the contents of sophora alkaloids and flavonoids from different habitats of Guizhou. Results: Active ingredient concentration ofS.flavescensvaried greatly from different habitats. Sophora alkaloids content were the highest from Dafang County of Bijie City and Sinan County of Tongren City, respectively 15.6% and 15.2%, significantly higher than that from other habitats. Flavonoids from Laoyingshan of Liupanshui City was the highest, which was 15.7%.

Sophoraflavescens; alkaloids; flavonoids; UV spectrophotometry; Guizhou

2015-10-23； 2016-04-25修回

貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項“黔產大宗藥材金櫻子、苦參質量評價研究”[黔科合ZY字(2012)3004]，“貴州省15種重點發展藥材的加工炮制技術集成及產業應用”[黔科合重大專項字(2015)6009-2]

陸平祝(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：生藥學。E-mail: 1435962566@qq. com

*通訊作者：常楚瑞(1973-)，女，副教授，博士，從事生藥學及中草藥研發工作。E-mail：changchurui@hotmail.com

1001-3601(2016)05-0218-0120-04

S567.5+3

A