不同方法對紅托竹蓀多糖的脫蛋白效果

葉 敏， 文 竹， 王 慶， 薛天樂， 梁光偉

(1.畢節學院 化學工程學院， 貴州 畢節 551700； 2.亳州職業技術學院， 安徽 亳州 236800)

不同方法對紅托竹蓀多糖的脫蛋白效果

葉 敏1， 文 竹1， 王 慶2， 薛天樂2， 梁光偉1

(1.畢節學院 化學工程學院， 貴州 畢節 551700； 2.亳州職業技術學院， 安徽 亳州 236800)

為保證多糖的藥理活性，以蛋白脫出率和多糖損失率為考察指標，比較Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法和酶-Sevag聯用法對紅托竹蓀粗多糖脫蛋白的效果。結果表明：木瓜蛋白酶法脫蛋白效果最佳，其最佳脫蛋白條件為木瓜蛋白酶濃度4%、酶解溫度55℃、酶解時間3 h，酶液pH 6.0，在此條件下，蛋白脫出率為77.97%，多糖損失率為19.31%。該法用于脫除紅托竹蓀多糖蛋白質的工藝簡單，成本低，具有一定的應用價值。

紅托竹蓀； 多糖； 脫蛋白方法

紅托竹蓀(Dictyophorarubrovalvata)是一種擔子菌，隸屬真菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、腹菌綱(Gasteromycetes)、鬼筆目(Phallales)、鬼筆科(Phallaceae)、竹蓀屬(Dictyophora)，是名貴的大型食用菌之一，野生紅托竹蓀主要分布在我國貴州中(西)部、云南、四川和浙江等省，多生長于竹林下的腐殖土上[1]。紅托竹蓀是竹蓀家族的珍品，含有豐富的氨基酸、維生素、無機鹽和多糖，其中多糖是紅托竹蓀子實體中重要組成成分之一，連賓等[2]研究發現，紅托竹蓀多糖的單糖組成為半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖。食用菌生物多糖是一種非特異性免疫增強劑和免疫激活劑，廣泛用于醫藥和保健食品，被稱為生物應答調節劑[3]。紅托竹蓀多糖的分離純化及其藥理活性的前期研究發現，紅托竹蓀多糖具有體外抗氧化活性[4]。植物多糖中常常混有較多的蛋白質，蛋白質的存在不僅會影響多糖的生理活性和多糖的結構，還會導致多糖的藥理活性發生變化[5]。為保證多糖的藥理活性，筆者研究比較幾種紅托竹蓀的多糖脫蛋白工藝，以期為紅托竹蓀資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料：紅托竹蓀子實體購于貴州省畢節市織金縣，于50℃干燥至恒重，粉碎，過40目篩，備用。

試劑：葡萄糖標準品(中國藥品生物制品鑒定所110833-200901)，考馬斯亮藍G-250(Amresco公司)，牛血清蛋白(Amresco公司)，其余試劑均為國產分析純，試驗用水為蒸餾水。

儀器：GL-20G-C臺式高速離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司)，TG16臺式高速離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司)，V-5800可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)，SZ-97A自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，旋轉蒸發器RE-2008B(上海亞榮生化儀器廠)，電熱干燥箱202-3(金壇市精達儀器制造廠)。

1.2 多糖的提取

多糖的提取參照文獻[6]的方法進行。紅托竹蓀粉末→脫脂(75%乙醇浸泡48 h)→熱水浸提→離心取上清液→減壓濃縮→醇沉(3倍體積的95%乙醇，置于4℃冰箱靜置過夜)→沉淀→洗滌(無水乙醇、丙酮、無水乙醚)→干燥(60℃電熱干燥箱)→紅托竹蓀粗多糖。

1.3 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[7]測定多糖含量，以葡萄糖為標準品，在490 nm條件下測定吸光度，得回歸方程y=0.020 7x+0.089 7。式中，x為葡萄糖含量(μg/mL)，y為吸光度，R2=0.999 1。

多糖損失率=[(脫蛋白前多糖含量—脫蛋白后多糖含量)/脫蛋白前多糖含量]×100%。

1.4 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法[8]測定蛋白質含量，以牛血清蛋白質為標準品，在595 nm條件下測定吸光度，得回歸方程y=0.100 4x+0.711。式中，x為蛋白含量(μg/mL)，y為吸光度，R2=0.999 0。

蛋白脫除率=[(脫蛋白前蛋白含量—脫蛋白后蛋白含量)/脫蛋白前蛋白含量]×100%。

1.5 脫蛋白方法的考察

1.5.1 Sevag法

1) 脫蛋白次數的確定[9]。取50 mL濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液，加入1/3倍體積的Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，震蕩30 min，靜置30 min待分層穩定，除去水相與有機相間的蛋白質；取上清液在3 500 r/min離心15 min，然后繼續加入Sevag試劑，5次重復，取上清液，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

2) 氯仿與正丁醇體積比的確定[10]。取濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液5份，各50 mL，分別加入1/3倍體積的Sevag試劑，Sevag試劑中氯仿與正丁醇的體積比分別為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，震蕩30 min，靜置30 min待分層穩定，除去水相與有機相間的蛋白質；3 500 r/min離心15 min，取上清液，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

3) 粗多糖溶液與Sevag試劑體積比的確定[11]。取濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液5份，各50 mL，多糖溶液與Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)的體積比分別為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，震蕩30 min，靜置30 min待分層穩定，除去水相與有機相間的蛋白質；3 500 r/min離心15 min，取上清液，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

1.5.2 木瓜蛋白酶法 參照文獻[1-12]的方法進行考察。

1) 酶濃度。取10 mL pH值已調為6.0的2 mg/mL紅托竹蓀粗多糖溶液5份，分別加入終濃度為1%、2%、3%、4%和5%的木瓜蛋白酶，搖勻后于55℃酶解2.5 h，結束后于沸水浴10 min滅酶，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

2) 酶解溫度。取10 mL pH已調為6.0的2 mg/mL紅托竹蓀粗多糖溶液5份，分別加入4%的木瓜蛋白酶，于45℃、50℃、55℃、60℃和65℃酶解2.5 h，結束后于沸水浴10 min滅酶，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

3) 酶解時間。取10 mL 已調pH 6.0的2 mg/mL紅托竹蓀粗多糖溶液5份，分別加入4%的木瓜蛋白酶，于55℃下分別酶解1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h，結束后于沸水浴10 min滅酶，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

4) 酶液pH。取濃度為2 mg/mL紅托竹蓀粗多糖溶液5份，各10 mL，當木瓜蛋白酶用量為4%，酶解溫度為55℃時，分別在pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5條件下保溫酶解2.5 h，結束后于沸水浴10 min滅酶，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

5) 正交試驗。在單因素試驗的基礎上，以蛋白脫除率和多糖保留率的綜合評分為指標，選取酶用量、酶解溫度、酶解時間和酶液pH作為考察因素進行L9(34)正交試驗，因素和水平見表1，以優化木瓜蛋白酶脫蛋白的試驗條件。

表1 酶法脫蛋白的正交試驗因素及水平

1.5.3 三氯乙酸(TCA)法 參照文獻[5]的方法進行。取濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液5份，各10 mL，分別加入5%、6%、7%、8%和9%等體積的三氯乙酸水溶液，震蕩30 min，靜置1 h，3 500 r/min條件下離心15 min，取上清液，測定蛋白質脫出率和多糖損失率。

1.5.4 酶-Sevag法脫蛋白 參照文獻[13]的方法進行。取濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液50 mL，加入4%的木瓜蛋白酶，調節pH 6.0，55℃水浴中酶解2.5 h，沸水浴10 min滅酶，冷卻后向粗多糖溶液中加入1/3體積Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，震蕩30 min，3 500 r/min離心15 min，去除沉淀，然后繼續加入Sevag試劑，重復處理5次，取上清液，測定蛋白質脫除率和多糖損失率。

2 結果與分析

2.1 Sevag法

從圖1可知，Sevag法脫蛋白3次后，蛋白脫出率沒有明顯升高，而多糖損失率卻迅速上升，經過5次脫蛋白后，蛋白脫出率達57.64%，多糖損失率達50.33%。因此，Sevag法脫蛋白3次為最佳，此時蛋白脫出率為62.04%，多糖損失率為31.34%。當氯仿與正丁醇比例為4∶1時，蛋白脫出率最高達66.61%，多糖損失率為10.45%。因此，氯仿與正丁醇的最適比例為4∶1。粗多糖溶液與Sevag試劑按3∶1和4∶1混合后，蛋白脫出率分別為69.24%和68.19%，二者間沒有明顯差異，多糖損失率分別為12.35%和14.25%，3∶1時的多糖損失率低于4∶1，因此粗多糖溶液與Sevag試劑的最適體積比為3∶1。

圖1 不同影響因素紅托竹蓀多糖的蛋白脫出率和多糖損失率

Fig.1 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide with different influencing factors

試驗結果表明，氯仿與正丁醇體積比對蛋白質脫出率和多糖損失率有影響，粗多糖溶液的體積過多或過少，都會影響蛋白質的脫出率，Sevag試劑處理次數越多，多糖損失率越高。綜上所述，對Sevag法脫蛋白條件進行驗證，即粗多糖溶液中加入1/3倍體積的Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，脫蛋白3次，測得蛋白質脫出率為64.03%，多糖損失率為30.07%。

2.2 酶法

2.2.1 不同因素對酶法脫蛋白效果的影響 由圖2可知，隨著木瓜蛋白酶濃度的升高，蛋白脫除率逐漸增加，在酶濃度達4%時趨于平穩，此時蛋白脫出率為76.98%，多糖損失率為28.49%；隨酶解溫度的升高，蛋白脫除率呈先上升后降低趨勢，在55℃時，酶活性最強，蛋白脫出率為70.12%，多糖損失率為25.64%；隨著酶解時間的增加，蛋白質的脫除率明顯增加，在酶解時間達2.5 h后蛋白脫除率變化不明顯，多糖損失率隨時間延長而升高；隨著pH的增加蛋白質脫出率呈先上升后下降的趨勢，在pH 6.5時達最高，為71.53%，多糖損失率隨著pH的增高而降低，降低幅度不大。

圖2 不同酶濃度、酶解溫度、酶解時間和酶液pH紅托竹蓀多糖的蛋白脫出率和多糖損失率

Fig.2 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide with different enzyme concentration, enzymolysis temperature，enzymolysis time and enzymolysis solution pH

2.2.2 酶法脫蛋白正交試驗結果 采用綜合加權評分法[11]，權重系數均為0.5，分別把蛋白脫出率和多糖保留率中最大的指標定為100分，其他各項綜合評分=(每次脫蛋白率/每組最高脫蛋白率)×0.5×100+(每次多糖保留率/每組最高多糖保留率)×0.5×100，計算結果見表2。對表2中正交試驗結果的綜合評分進行極差分析(表3)可知，4個因素對綜合評分的影響程度不同，由高到低依次為A(酶濃度)>C(酶解時間)>D(酶液pH)>B(酶解溫度)，以D(酶液pH)作為誤差項進行方差分析可知，A(酶濃度)的F值為28.103>F臨界值(19.00)，對綜合評分有顯著性影響，其他因素均無顯著性影響。隨著酶濃度的增加，酶與底物接觸的機會也增加，蛋白質脫除效果增大，溫度升高可以加速酶促反應速度，同時也會加速酶蛋白變性而失去活性，酶的活性在一定pH條件下表現最大的活力，適當延長酶解時間可增加酶促反應速度。因此，酶法脫蛋白的最佳條件為A2B2C3D1，即酶濃度4%、酶解溫度55℃、酶解時間3 h，酶液pH 6.0。

表2 紅托竹蓀多糖酶法脫蛋白正交試驗的綜合評分

Table 2 Comprehensive score ofD.rubrovalvatapolysaocharide of orthogonal experiment by enzymic method to remove protein

試驗號No．酶濃度(A)/%Enzymeconcentration酶解溫度(B)/℃Enzymolysistemperature酶解時間(C)/hEnzymolysistime酶液pH(D)EnzymolysissolutionpH蛋白質脫出率/%Proteinremovalrate多糖保留率/%Polysaccharideretentionrate綜合評分/%Comprehensivescore1350．02．06．067．8478．1690．902355．02．56．567．4874．3688．383360．03．07．063．6279．1188．754450．02．57．069．2481．9694．675455．03．06．077．5082．9199．436460．02．06．576．6275．3194．857550．03．06．573．2870．5689．838555．02．07．066．6174．3687．819560．02．56．068．1972．4687．69

表3 紅托竹蓀多糖酶法脫蛋白正交試驗各因素水平綜合得分的均值與極差

Table 3 The average and range of the comprehensive score ofD.rubrovalvatapolysaocharide of various factors and levels on orthogonal experiment by enzymic method to remove protein

均值Meanvalue酶濃度(A)/%Enzymeconcentration酶解溫度(B)/℃Enzymolysistemperature酶解時間(C)/hEnzymolysistime酶液pH(D)EnzymolysissolutionpHk189．34391．80091．18792．673k296．31791．87390．24791．020k388．44390．43092．67090．410R7．8741．4432．4232．263

2.2.3 驗證試驗 根據正交試驗的最佳條件，取粗多糖溶液10 mL，共3份，按最佳條件重復3次試驗，計算平均蛋白脫出率為77.97%，平均多糖損失率為19.31%。

2.3 三氯乙酸(TCA)法

由圖3可知，隨著TCA濃度的增加，粗多糖溶液中蛋白脫出率逐漸增加，但多糖損失率也逐漸上升。TCA是酸性物質，能使蛋白質帶正電荷從而與酸根負離子結合成不溶性的鹽類，并伴隨蛋白質分子變性，但TCA同樣會對多糖產生破壞[13]。當TCA濃度為6%時，蛋白脫出率為66.96%，多糖損失率為18.99%；當TCA濃度大于6%時，蛋白脫出率緩慢增加，而多糖損失率快速上升，達41.79%。因此，TCA濃度為6%時，脫蛋白效果最好。

圖3 不同濃度TCA紅托竹蓀多糖的蛋白脫出率和 多糖損失率

Fig.3 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide with various concentrations of TCA

圖4 紅托竹蓀多糖酶-Sevag法的蛋白脫出率和多糖損失率

Fig.4 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide detected by enzyme-Sevag method

2.4 酶-Sevag法

由圖4可以看出，酶解后的粗多糖溶液，隨著Sevag法脫蛋白次數的增加，蛋白脫出率逐漸增加，當脫蛋白3次后，蛋白脫出率上升幅度不大，此時蛋白脫出率為63.62%；多糖的損失率也隨著Sevag法脫蛋白次數的增加而上升，經過5次處理后，多糖損失率達到40.84%。

3 結論

植物多糖的純度常受到自身所含植物蛋白的影響，其藥理研究結果往往出現較大差異，因此多糖脫蛋白是多糖純化的關鍵[14]。試驗比較了Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法和酶-Sevag法4種方法對紅托竹蓀多糖脫蛋白效果的影響。4種方法均不能使蛋白質完全脫除，還有殘留，可能是因為有部分蛋白質與多糖緊密結合形成糖蛋白而不容易除去。Sevag法在脫出游離蛋白質的同時可能會除去與蛋白質結合的多糖，因此，用Sevag試劑處理的次數越多，多糖的損失率也就越高，Sevag法需要消耗大量有毒有機溶劑，有機溶劑容易造成多糖活性下降和溶劑殘留[14]，因此，紅托竹蓀粗多糖溶液中加入1/3倍體積的Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，3次重復的脫蛋白效果最好；TCA溶液的濃度對脫蛋白的效果有較大影響，當TCA濃度為6%時，脫蛋白效果最好，多糖損失率最低；酶-Sevag法聯用沒有提高蛋白脫出率，可能是因為有機層的包裹使多糖損失率增加[15]；酶法是多糖除蛋白方法中較溫和且高效的一種，不引入有機試劑，可以避免總多糖大量降解[15]。因此，酶法對紅托竹蓀多糖脫蛋白效果最好。然而，不論是采用單一的方法還是采用酶-Sevag法，多糖溶液中仍會有部分蛋白質與多糖牢固結合形成的糖蛋白存在，如需獲得更純的多糖制品，還需要經過其他一系列的精制分離純化工藝[16]，對多糖中蛋白質的除去方法的選擇對多糖的降解程度和多糖藥理活性以及結構等的影響，還有待進一步的研究。

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(責任編輯： 孫小嵐)

Effects of Deproteinization forDictyophorarubrovalvataPolysaccharide by Different Methods

YE Min1， WEN Zhu1， WANG Qing2， XUE Tianle2， LIANG Guangwei1

(1.CollegeofChemicalEngineering，BijieUniversity，Bijie,Guizhou551700； 2.BozhouVocationalandTechnicalCollege，Bozhou,Anhui236800，China)

To guard the pharmacological activity of polysaccharide, four deproteinization methods including Sevag, trichloroacetic acid ( TCA)， papain method and combination of enzymatic and Sevag method were evaluated in terms of the removal rate of protein and the loss rate of polysaccharide.The results showed that papain method was the best， and the optimal conditions were as following: enzyme concentration 4%，enzymolysis temperature 55℃，enzymolysis time 3.0 h，pH 6.0. Under the above conditions，the removal rate of protein could reach 77.97%, the loss rate of polysaccharide was 19.31%. This process was simple, low cost and applicable for deproteinzation fromD.rubrovalvatapolysaccharide.

Dictyophorarubrovalvata; polysaccharide; deproteinization method

2015-08-17； 2016-03-04修回

貴州省科技廳、畢節市科技局、畢節學院科技聯合基金項目“紅托竹蓀多糖的分離純化及其藥理活性研究”[黔科合J字LKB(2012)06]

葉 敏(1979-)，女，副教授，從事天然產物生物活性研究。E-mail: 28719861@qq.com

1001-3601(2016)05-0221-0131-04

S39; TS201

A