深圳地區2003～2014年獻血者HIV血液篩查結果及其窗口期確認*

王　霞，許曉絢，吳桂丹，曾勁峰，杜　鵬，莊乃保

(深圳市血液中心，廣東深圳 518035)

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·論著·

深圳地區2003～2014年獻血者HIV血液篩查結果及其窗口期確認*

王霞，許曉絢，吳桂丹，曾勁峰，杜鵬，莊乃保

(深圳市血液中心，廣東深圳 518035)

摘要:目的分析深圳地區2003～2014年無償獻血者HIV感染率變化趨勢，以及研究HIV感染窗口期確認過程。方法2003～2014年共584 111例獻血者經進口與國產2種ELISA試劑及血液病毒核酸(NAT)檢測方法(2006年開始使用)篩查HIV項目，抗-HIV陽性樣品送疾病預防控制中心(CDC)確證，統計分析12年來獻血者HIV感染流行趨勢。另外，使用高靈敏度的熒光定量-PCR(Rt-PCR)方法對抗-HIV陰性/NAT陽性樣品確認HIV RNA的存在并隨訪跟蹤復查，以判定是否為HIV感染窗口期。結果深圳地區2003～2014年獻血人數逐年增長，抗-HIV篩查陽性率呈平穩下降趨勢，但經CDC確認為HIV感染的獻血者流行率則急劇升高，2014年的獻血者HIV感染率為2003年的26.61倍；感染HIV的獻血者中由同性性行為傳播的比例逐年升高。通過跟蹤復查、Rt-PCR檢測，4例抗-HIV陰性/NAT陽性樣品為HIV感染窗口期，深圳地區無償獻血者的HIV感染窗口期檢出率為1/117 995(4/471 978)。無償獻血者HIV感染率在男性組、18～<39歲組、已婚組、初次獻血組分別明顯高于女性組、39～<60歲組、未婚組、重復獻血組(P<0.05)，而非該地與該地戶籍組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論深圳地區的血液篩查機制與手段能較好地杜絕HIV感染窗口期帶來的輸血風險，有效保障輸血安全。

關鍵詞:無償獻血者；人類免疫缺陷病毒；病毒核酸檢測；熒光定量聚合酶鏈反應；窗口期

隨著分子生物學技術的發展及其在血液篩查檢測方面的應用，血液病毒核酸檢測(NAT)技術已能大大降低經輸血傳播病毒的風險[1-2]。相關研究顯示，乙型肝炎、丙型肝炎、HIV病毒的血清學標志物檢出時間上限分別為第30、65、19天，使用NAT技術能縮短至第10、2、3天[3-4]，可見NAT技術在乙型肝炎、丙型肝炎、HIV病毒感染的感染窗口期對血液篩查具有不可替代的作用，能最大限度地保障輸血安全。深圳市血液中心于2006年正式把NAT檢測作為血液篩查常規手段，作為全國第一批引進NAT檢測的城市，經過8年的應用，已經獲得詳細的獻血者血篩數據，本研究主要分析2003～2014年無償獻血者血液HIV的ELISA及NAT檢測結果，并對抗-HIV陰性，NAT陽性獻血者進行感染窗口期確認，以提供真實的獻血者HIV感染流行率及HIV輸血風險評估，為深圳地區的HIV傳染防控提供數據參考。

1資料與方法

1.1一般資料深圳市2003年1月至2014年12月無償獻血者584 111例，年齡18～55歲。獻血者在獻血前經乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)快速試紙條、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)干化學檢測初篩，合格者進行獻血并留樣送至檢驗科，使用ELISA及NAT方法篩查血站常規檢測項目。

1.2儀器與試劑ELISA檢測儀器：Microlab STAR全自動加樣儀、Xantus-200全自動加樣儀、Microlab FAME全自動ELISA分析系統、BEHRING(Ⅲ)ELISA處理系統、美國Biorad洗板機和Zenyth340rt恒溫酶標儀等。NAT檢測儀器：瑞士HIMILTON自動核酸提取儀、美國ABI核酸擴增檢測儀、瑞士HIMILTON STAR2000全自動匯集儀、美國TIGRIS全自動血液NAT系統。HBsAg膠體金試紙由杭州艾博生物醫藥有限公司提供；ALT干化學初篩試紙條由美國羅氏公司提供；ALT速率法檢測試劑盒由上海科華公司及澳斯邦生物公司提供；2003～2014年檢測抗-HIV的ELISA試劑來自多個公司及廠家，包括北京萬泰公司、珠海麗珠公司、荷蘭梅里埃公司及美國Bio-Rad公司。2003～2012年的ELISA檢測一直都是國產與進口2種試劑檢測，到2013年初開始使用1次進口ELISA加NAT試劑檢測。NAT試劑使用上海科華公司與美國諾華Procleix Ultrio assay NAT試劑。逆轉錄步驟使用TAKARA公司生產的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，由大連寶生物工程公司提供，批號D6110A；實時熒光定量-PCR(Rt-PCR)使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，由大連寶生物工程公司提供，批號DRR820A。Rt-PCR儀為美國安捷倫公司MX3005P型號。

1.3檢測方法

1.3.1NAT檢測2006～2009年使用上海科華公司生產的NAT檢測產品，按照產品要求，為“8人匯集池+再拆分”的混檢模式；2010年至今使用美國諾華公司的Procleix TIGRISNAT系統，為“三聯病毒檢測+可疑陽性鑒別”的單檢模式。所有試驗的操作均嚴格按照試劑盒說明書和《中國輸血技術操作規程》相關要求進行，以上試劑均批檢合格，不同批號試劑均在有效期內使用。

1.3.2血樣HIV RNA提取使用羅氏診斷公司的High Pure Viral Nucleic Acid核酸提取試劑盒(德國曼海姆羅氏診斷公司，批號14765344)提取1 mL血漿RNA，按說明操作進行,使用去RNA酶的實驗耗材，防止HIV RNA提取過程中降解。

1.3.3Rt-PCRRt-PCR定量鑒定HIV RNA采用兩步法：RNA逆轉錄與cDNA定量PCR。上下游引物分別為：HIV-F 5′-TAA AGC TTG CCT TGA GTG CT-3′/HIV-R 5′-GTC TGA GGG ATC TCT AGT TAC CAG-3′,探針HIV-Probe 5′-(Hex) AGT AGT GTG TGC CCG TCT GTT GTG-(BHQ2)-3′。

1.3.4獻血者HIV陽性確認本中心實驗室篩查抗-HIV陽性和抗-HIV陽性/NAT陽性的標本送至深圳市疾病預防控制中心(CDC)進行確認。

1.3.5HIV窗口期獻血者追蹤對于抗-HIV陰性/NAT陽性獻血者進行規律地追蹤復查，復檢項目包括抗-HIV、常規NAT及手工Rt-PCR確認。追蹤數據理論上需要有1個月后的數據，但實際情況因獻血者的流動性大等因素，可能存在缺少部分數據。

1.4統計學處理采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計學分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗中的Fisher確切概率法，采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.12003～2014年獻血者抗-HIV篩查結果深圳市血液中心從2003年開始獻血人數呈逐年上升，直到2014年獻血者數量比2003年增加將近1倍，達到68 423例。而2003～2014年抗-HIV的篩查陽性率總體呈下降趨勢。2003～2006年抗-HIV陽性率為緩慢增長期，于2007年明顯下降后，至2009年檢測抗-HIV陽性率達到最高，為0.36%(161/44 413)，此后至2014年逐年降至最低，為0.19%(132/68 423)。2003～2014年抗-HIV檢測總陽性率為0.25%(1 450/584 111)。見圖1。

圖1　　2003～2014年獻血者抗-HIV初篩陽性率

2.22003～2014年確認感染HIV獻血者情況本中心篩查結果為抗-HIV陽性的獻血者標本通過本市CDC確認，結果顯示與2003年相比，2014年的獻血者HIV感染率呈急劇上升趨勢(感染率由2003年的0.28/10 000上升到2014年的7.45/10 000，升高約26.61倍)；2003～2009年獻血者HIV感染率平穩升高，于2010年急劇升高至4.77/10 000，在2010～2013年又處于平穩感染狀態，最后至2014年出現新的HIV感染率飛躍，達到7.45/10 000。見圖2。

圖2　　2003～2014年獻血者確認HIV感染率

2.32006～2014年獻血者HIV感染窗口期情況及確認本中心從2006年正式把NAT檢測作為血液篩查常規技術，通過統計完整的ELISA及NAT數據，2006～2014年共篩查出4例抗-HIV陰性/NAT陽性獻血者，均為男性，25～40歲，成功追蹤復查3例獻血者，有2例仍處于抗-HIV陰性/HIV RNA陽性的窗口期感染狀態，1例已經出現抗-HIV陽轉/HIV RNA陽性，成為HIV顯性感染狀態；另有1例(4號)獻血者因不配合追蹤程序，通過本市CDC接受隨訪復查確認為HIV感染。故4例初篩為抗-HIV陰性/NAT陽性的獻血者通過追蹤及Rt-PCR確證HIV RNA存在，確認為HIV感染窗口期。見表1。

2.4不同特征獻血者的HIV感染率比較無償獻血者HIV感染率在男性組、18～<39歲組、已婚組、初次獻血組分別明顯高于女性組、39～<60歲組、未婚組、重復獻血組(P<0.05)，而非本地與本地戶籍組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1　　4例抗-HIV陰性/NAT陽性獻血者基本信息及追蹤結果

*：CDC接受隨訪，確認感染。

表2　　2003～2014年總獻血者HIV感染率在

3討論

本文統計分析了深圳市血液中心2003～2014年無償獻血者HIV篩查及CDC確證HIV感染者的數據，旨在了解本市獻血者人群12年來的HIV感染流行趨勢，為無償獻血者招募提供基礎數據。本中心使用ELISA方法初篩獻血者抗-HIV的陽性率，在2003～2014年總體呈平穩下降趨勢，只在2007年及2009年出現較大的變化波動，而在2012～2014年抗-HIV陽性率更趨于平穩。但實際上，經過CDC對抗-HIV陽性樣品的確證，2003～2014年無償獻血者HIV感染率從0.28/10 000上升到7.45/10 000，增長26.61倍，與本中心實驗室篩查抗-HIV陽性率總體下降的方向相反，這可能與本中心近年來所用篩查抗-HIV的試劑靈敏度與特異度增高，而抗-HIV假陽性率降低有關[5]。

圖2示深圳地區2012～2014年的獻血者確證HIV感染率為4.78/10 000～7.45/10 000，高于同期南京地區的1.10/10 000～2.10/10 000[6],2010～2013年的4.77/10 000～5.63/10 000高于同期廣州地區的2.00/10 000～3.50/10 000[7],2010～2012年的4.77/10 000～5.63/10 000高于同期北京地區的2.11/10 000～3.94/10 000[8]，而在2003～2009年深圳地區獻血人群HIV感染率為0.28/10 000～1.43/10 000，低于同期北京的0.54/10 000～1.74/10 000[8]，甚至低于其他地區[9]，可見深圳地區在2010年開始獻血者人群的HIV流行率明顯升高，是2009年的3.53倍(4.77∶1.35，圖2)。據文獻報道，2010年深圳地區CDC新確認HIV感染者及男男性行為獻血者HIV相比上1年出現明顯升高[10-12]，而獻血者作為普通人群的組成部分，這可能為2010年開始獻血者人群HIV感染率突然增長的原因之一。同樣圖2可見，2014年的獻血者HIV感染率又一次出現飛躍性升高，是2013年的1.56倍(7.45∶4.78，圖2)，查詢本中心對HIV感染獻血者的傳播途徑背景數據可發現，2009年HIV感染獻血者有33.30%為同性傳播，到2014年這一比例上升至65.30%，顯示傳染HIV的途徑已偏向同性性行為，異性行為及吸毒注射傳播比例逐漸下降，應引起有關部門的重視。無償獻血者是社會普通人群的組成部分，HIV感染獻血者群體的病毒傳播途徑多數為同性性行為，也提示普通人群的主要HIV感染途徑可能與之類似，故本數據可為CDC對HIV的預防策略提供借鑒。本中心通過酶免及核酸檢測技術篩查出4例抗-HIV陰性/NAT陽性獻血者，回訪調查發現其中2例存在同性性行為，充分說明帶著檢測HIV動機的獻血者風險性極高。通過隨訪跟蹤、Rt-PCR技術確認HIV RNA存在及CDC進一步流調，可判定4例抗-HIV陰性/NAT陽性獻血者是否為HIV感染窗口期，表1示樣品1、2、3均成功追蹤隨訪，使用血站常規NAT檢測及Rt-PCR兩種方法、不同擴增引物檢測核酸，可確證HIV RNA的存在[13]，排除常規核酸檢測假陽性結果。樣品1、3完成1次追蹤，結果仍為抗-HIV陰性/HIV RNA陽性，血清學抗體未轉陽，仍處于感染窗口期；樣品2于第2次追蹤出現抗-HIV陽轉/HIV RNA陽性，成為顯性HIV感染者；樣品4因獻血者不配合追蹤程序，CDC隨訪跟蹤，后來確認為HIV感染者。故該4例獻血者均判定為HIV感染窗口期，深圳地區2006～2014年無償獻血者HIV感染窗口期檢出率為1/117 995(4/471 978)，高于韓國地區的1/1 080 244[14]及加拿大地區的1/8 000 000[15]。4例窗口期獻血者均為男性，學歷分布高低級階段，3/4例未婚，本研究通過成熟的追蹤回訪機制，科學完成HIV窗口期的確認及獻血者資料信息獲得，充分體現本中心的NAT篩查手段與手工核酸擴增技術的重要作用，為降低血液潛在風險起到不可或缺作用，保障了輸血安全。

表2分析了193例確認感染HIV的獻血者在不同特征信息上的分布情況，可發現男性、18～<39歲、已婚及初次獻血者組的HIV感染率高于其對立組(P<0.05)，這為獻血前咨詢預防HIV高危獻血者提供基礎依據。本研究主要價值在于，一是獲得長達12年來的獻血者HIV感染趨勢，2014年獻血者HIV感染率是2003年的26.61倍，有關部門應高度重視HIV傳播問題，本數據對深圳地區人群HIV防控具有重要意義；二是建立手工擴增HIV RNA的高靈敏度Rt-PCR方法，同時展示了4例抗-HIV陰性/NAT陽性獻血者的窗口期確認過程，為血液篩查中HCV、HBV窗口期的確證提供借鑒方法；另外，窗口期樣品檢出為后期輸血風險評估提供支撐數據，充分肯定了NAT技術在血篩中保障輸血安全的貢獻。

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HIV blood screening results and its window period confirmation in blood donors in Shenzhen area during 2003-2014*

WangXia,XuXiaoxuan,WuGuidan,ZengJinfeng,DuPeng,ZhuangNaibao

(ShenzhenMunicipalBloodCenter,Shenzhen，Guangdong518035,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the change trend of HIV infection rate among volunteer donors in Shenzhen area during 2003-2014 and investigate the confirmation process of HIV window infection period.MethodsThe HIV screening items in 584 111 blood donors samples were performed by ELISA with both domestic and imported reagents and the viral nucleic acid (NAT) detection method (starting from 2006).The samples with anti-HIV positive were submitted to the center for disease control(CDC) for conducting the confirmation of HIV infection.The prevalent trend of HIV infection rate in blood donors was statistically analyzed.Moreover,the highly sensitive fluorescent quantitative method(Rt-PCR) was used to confirm the existence of HIV RNA in the samples with anti-HIV negative/ NAT test positive and the follow up was performed to conduct the retest for judging whether being the HIV window infection period.ResultsThe number of blood donors was increased year by year during 2003-2014 and the positive rate of anti-HIV screening demonstrated the steadily declining trend,but the prevalence rate of HIV infected donors confirmed by CDC was sharply increased,the HIV infection rate of blood donors in 2014 was 26.61 times of that in 2003,among them,the transmission proportion by homosexual behavior was elevated year by year.Through following up retest and Rt-PCR detection,4 samples of anti-HIV negative /NAT positive were finally identified as the window infection period,the detection rate of HIV window infection period in Shenzhen area was 1/117 995(4/471 978).The infection rate of HIV in the male group,18-<39 years old group,married group and first-time donor group among voluntary donors were significant higher than that in the female group,39-<60 years old group,unmarried group and re-donation group(P<0.05).However,there was no statistically significant difference between the locality census register group and local household registration group(P>0.05).ConclusionThe blood screening system and measures in Shenzhen area could better eradicate the blood transfusion risk brought by the HIV window infection period and effectively ensure the blood transfusion safety.

Key words:blood donors;human immunodeficiency virus;virus nucleic acid detection;fluorescence quantitative polymerase chain reaction;window period

(收稿日期：2015-10-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.005

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0299-04

作者簡介：王霞，女，主管護師，主要從事血液采集、質量控制與血液安全研究。

*基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金項目(B2014358)。