人乳頭瘤病毒、端粒酶基因及3號染色體數目與宮頸病變關系的探討

李亞波，楊　雋，丁世霖，楊紅英，王　卓△

(1.云南省中醫院檢驗科，云南昆明 650021；2.云南省中醫院治未病中心，云南昆明 650021；3.云南省

中醫院泌尿外科，云南昆明 650021；4.昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，云南昆明 650101)

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·論著·

人乳頭瘤病毒、端粒酶基因及3號染色體數目與宮頸病變關系的探討

李亞波1，楊雋2，丁世霖3，楊紅英4，王卓4△

(1.云南省中醫院檢驗科，云南昆明 650021；2.云南省中醫院治未病中心，云南昆明 650021；3.云南省

中醫院泌尿外科，云南昆明 650021；4.昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，云南昆明 650101)

摘要:目的探討人端粒酶(TERC)基因的表達和人乳頭瘤病毒(HPV)感染及3號染色體數目突變與宮頸病變的關系。方法2008年6月至2009年2月昆明醫學院第二附屬醫院婦科門診接受診治者共81例，其中健康組(病檢結果正常)20例，子宮頸上皮非典型增生(CIN)1組28例，CIN2組12例，CIN3組9例，宮頸癌組12例。采用熒光原位雜交技術(FISH)進行子宮頸上皮脫落細胞TERC基因的檢測，同時利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQPCR)技術檢測這81例受試者的HPV感染情況。并進行宮頸癌與TERC基因和HPV的相關性分析。同時記錄81例受試者3號染色體數目突變情況。結果在宮頸病變檢測中TERC基因檢測和HPV檢測陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，二者陽性率在CIN1組、CIN2組、CIN3組和宮頸癌組均明顯高于健康組(P<0.05)，CIN1組與CIN2組差異無統計學意義(P>0.05)，CIN3組與宮頸癌組差異有統計學意義(P<0.05)，惡性程度越高，二者陽性率越高。健康組和CIN1組3號染色體數目異常突變率為0%；CIN2組為16.7%；CIN3組為66.7%；宮頸癌組為100.0%，CIN3組和宮頸癌組陽性率明顯高于健康組、CIN1組CIN2組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論在宮頸癌的發生、發展過程中TERC基因異常表達、高危HPV感染、3號染色體數目的突變可能起著重要的協同作用。

關鍵詞:宮頸病變；人端粒酶基因；人乳頭瘤病毒；3號染色體；熒光原位雜交

宮頸癌是嚴重威脅女性健康的疾病，目前研究認為與宮頸癌關系較為密切的是人乳頭瘤病毒(HPV)與人端粒酶(TERC)基因，TERC的表達上調可阻止細胞凋亡，可導致腫瘤產生，端粒酶的激活可能是宮頸癌發生的早期事件，因此端粒酶可作為宮頸癌及癌前病變的有效標志物。高危型HPV感染在宮頸癌及癌前病變中的重要作用已得到公認。本研究應用熒光原位雜交技術(FISH)檢測TERC和熒光定量聚合酶鏈反應(FQPCR)技術檢測HPV，探討宮頸癌與TERC基因表達及HPV感染的相關性，在進行二者與宮頸癌的關系研究中，發現3號染色體數目也存在異常改變，現對三者與宮頸癌的關系報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2008年6月至2009年2月昆明醫學院第二附屬醫院婦科門診接受診治的女性共81例，其中健康組(病檢結果正常)20例，子宮頸上皮非典型增生(CIN)1組28例，CIN2組12例，CIN3組9例，宮頸癌組12例，所有研究對象年齡22～68歲。納入標準：按照宮頸上皮內瘤樣病變診斷處理規范，分組及宮頸癌診斷按照《婦產科學(第6版)》相關診斷標準進行[1]。

1.2標本采集患者先行病理組織學檢查，確定其組織學診斷結果后行脫落細胞取材。(1)脫落細胞取材采用薄層液基細胞學(TCT)檢查，專用宮頸刷插入宮頸口，在宮頸外口鱗柱狀上皮交界處，以宮頸外口為中心，均勻旋轉3～5周，取出宮頸刷，放入TCT保存液瓶中，漂洗采樣器，送檢。(2)HPV標本采集，用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，用無菌棉拭子插入宮頸內，停留5 s后旋動棉拭子采集宮頸分泌物，放入無菌試管內密閉送檢。

1.3檢測方法

1.3.1TERC檢測將對應的病檢正常、CIN1、CIN2、CIN3及宮頸癌患者的TCT保留液中的脫落細胞，采用FISH檢測其TERC的表達。雜交使用的探針由北京金菩嘉醫療科技有限公司提供。DNA探針包含2種，在中期染色體與間期核上均能雜交產生明亮的信號。靈敏度與特異度均達98%以上，與非目的染色體無交叉雜交反應。TERC DNA 探針雜交到人類3號染色體長臂(3q26，3)，覆蓋整個TERC基因，熒光為橘紅色，對照探針為CSP3,探針雜交信號位于人類3號染色體3p11.1～q11.1，覆蓋整個著絲粒區域，熒光信號為綠色。

1.3.2HPV檢測采用中山大學達安基因股份有限公司提供的試劑檢測HPV，使用美國Mjopticon2 FQPCR檢測儀進行擴增分析。

1.4診斷標準

1.4.1結果分析正常細胞：細胞核中紅色和綠色信號各2個；TERC基因表達異常細胞：紅色信號大于2個，綠色信號不少于2個(綠色信號探針覆蓋于著絲粒上，染色體數為二倍體時，綠色信號為2個，當染色體數目發生變異時，如三倍體﹑四倍體時綠色信號就大于2個。)

1.4.3結果判斷每份標本隨機計數100個細胞，如果檢測值大于閾值，判定為TERC基因表達的陽性患者；如果檢測值小于閾值，判定為無TERC基因表達的陰性患者。

1.5統計學處理采用dyes統計軟件進行數據處理及統計學分析。由于進行分析的數據資料是TERC基因和HPV的陽性百分比，故分析時通過平方根反正弦變換，將原始數據開平方根再取反正弦后使用。多組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1TERC與HPV檢測陽性率比較在對81例受試者的宮頸病變檢測中，FISH檢測TERC陽性率與FQPCR對HPV檢測的陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2不同病變程度患者的TERC與HPV檢測陽性率比較TERC基因與HPV的陽性率隨病變級別升高而增加，CIN1組、CIN2組及CIN3組與健康組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；各病變組間相比，CIN1組與CIN2組差異無統計學意義(P>0.05)；CIN3組與CIN1組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；CIN3組與宮頸癌組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。不同病變程度患者的TERC與HPV檢測陽性率見表1～2。

表1　　各組宮頸脫落上皮細胞TERC基因表達與

*：P<0.05，與健康組比較；#：P<0.05，與CIN1組比較；△：P<0.05，與宮頸癌組比較。

表2　　各組宮頸脫落上皮細胞TERC基因表達與HPV

2.33號染色體數目異常突變率在健康組和CIN1組3號染色體數目異常突變率為0%；CIN2組為16.7%；CIN3組為66.7%；宮頸癌組為100.0%。CIN3組和宮頸癌組陽性率明顯高于健康組、CIN1組、CIN2組，差異有統計學意義(P<0.05)。3號染色體數目變異陽性率隨著宮頸病變惡性程度升高而上升，在健康組、CIN1組及CIN2組中不易見到3號染色體數目的變異，但在CIN3組和宮頸癌組中3號染色體數目變異陽性率明顯上升，該變異常伴隨著TERC基因的異常擴增。

3討論

流行病學和生物學資料已證明HPV感染是引起宮頸癌及癌前病變的重要危險因素，HPV的感染在宮頸癌前病變中很普遍，但只有很少的一部分感染者最后發展為宮頸癌，這與HPV感染的過程有關，在感染的初期，HPV是以游離狀態存在的，在CIN1中HPV的整合比較少見，甚至是缺乏的，但在大部分浸潤性宮頸癌中，HPV都會整合到宿主細胞上，整合后引起E6、E7基因的過度表達，導致P53的降解，P53丟失或失活會減少有絲分裂的準確性，增加基因組重排的頻率[2]。導致含有高危HPV宿主細胞的染色體不穩定，發生基因突變，突變的細胞大量增生，反復合成DNA，最終出現多倍體和非整倍體[3]。

近年來國內外相關研究表明，端粒酶活性在宮頸癌的發生、發展過程中起重要作用，端粒酶的激活可能發生在宮頸癌的早期，隨著病變的發展，端粒酶的活性表達增高[4-8 ]。Heselmeyer-Haddad等[8]采用FISH三色探針對已染色的細胞學涂片進行TERC基因檢測，發現在所有CIN1、CIN2的患者中為二倍體模式無TERC基因異常表達的，最終自行修復為正常細胞，這種CIN情況一般是生理狀態下自然形成的；有TERC基因異常表達的非二倍體模式在不經治療的情況下是不會自行消退到正常狀態的，都向宮頸癌方向發展，提示 3號染色體數目的突變與TERC基因激活一起參與宮頸癌的病變過程。國外的研究顯示，在浸潤性宮頸癌中HPV的整合與TERC基因的異常表達緊密聯系在一起[9-11]，2006年Hopman 等[12]的對比研究中證實，在從宮頸上皮發育不良發展到浸潤性宮頸癌的過程中，HPV基因的整合與TERC基因的表達有緊密關系。在病變發展過程中，HPV從游離狀態整合到宿主細胞內是一個重要的危險因素，TERC基因的異常表達和HPV的基因整合能夠推動形成非整倍體細胞。但并不是所有HPV陽性的細胞都會出現TERC基因異常表達，10例存在HPV整合的二倍體病變中只有8例有TERC基因異常表達，這就意味著HPV病毒整合到宿主細胞后存在兩種不同的發展方向，其中之一就是與染色體基因突變無關[13]，而染色體基因的突變在宮頸癌的形成過程中起著關鍵作用，這也許可以說明為什么在宮頸癌前病變中HPV的感染很普遍，但只有極少的一部分最終發展為浸潤性宮頸癌。

本研究中20例健康人正常的宮頸脫落上皮細胞中無TERC基因的異常表達，而在CIN至宮頸癌中TERC基因的異常表達呈遞增趨勢，且宮頸癌中陽性表達率是100.0%，明顯高于不同分期CIN(P<0.05)，提示TERC基因的異常表達存在于宮頸癌的發生、發展過程中，惡性程度越高，異常表達率越高。12 例宮頸癌中HPV陽性率是91.7 %，TERC基因表達陽性率是100.0%，提示TERC基因異常表達在宮頸癌的發生、發展過程中起著關鍵作用。

3組CIN患者中均有HPV陽性而TERC基因表達陰性的病例，提示不是所有HPV陽性的患者都會出現TERC基因的陽性表達，這說明只有HPV整合到宿主細胞后才可能在宮頸癌的形成過程中，具有致癌性。在宮頸癌的發展過程中伴隨TERC基因異常表達出現的HPV陽性率隨著病變惡性程度的增加而逐漸上升，在宮頸癌中陽性率最高達到91.7%，二者的同時出現可能說明在宮頸癌的發展中HPV與TERC基因有著某種協同作用。

研究中，通過CSP3對照探針的綠色信號客觀地反映出TERC基因異常表達的細胞中存在非二倍體細胞。隨著病變惡性程度的增加，非二倍體細胞出現的頻率也增加，在CIN1和CIN2中二倍體多見，幾乎見不到非二倍體，在CIN3中非二倍體比例升高，宮頸癌中最高，提示染色體數目的變異可能與宮頸癌的發生有一定的聯系。

綜上所述，TERC基因異常表達和高危HPV感染與宮頸癌的發生、發展密切相關。在宮頸癌的發生、發展過程中，TERC基因異常表達、高危HPV感染、3號染色體數目的突變可能起著重要的協同作用。

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Study on relationship between human papilloma virus,telomerase gene and chromosome 3 number with cervical lesions

LiYabo1,YangJun2,DingShilin3,YangHongying4,WangZhuo4△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.CenterforPreventiveTreatmentofDiseases;3.DepartmentofUrologicSurgery,

YunnanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming,Yunnan650021,China;4.Departmentof

ClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650101,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between the expression of human telomerase RNA component(TERC) gene,human papilloma virus (HPV) infection and mutation of chromosome 3 number with cervical lesions.Methods81 women received the treatment in the Gynecology Department of the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University from June 2008 to February 2009,including the healthy group(normal pathological examination,20 cases),CIN1 group(28 cases),CIN2 group(12 cases),CIN3 group(9 cases) and cervical cancer group(12 cases).The TERC gene expression in uterine epithelial exfoliated cells was detected by using the fluorescence in situ hybridization(FISH) method,meanwhile the HPV infection was detected by using the real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQPCR) technology.The correlation between cervical cancer with TERC gene and HPV was analyzed.At the same time the number of chromosome 3 mutations in 81 cases was recorded.ResultsIn the cervical lesion detection,the detection positive rate had no statistical difference between the TERC gene detection and HPV detection (P>0.05),their positive rates in the CIN1,CIN2,CIN3 and cervical cancer groups were significantly higher than that in the healthy group (P<0.05),the difference between the CIN1 group and the CIN2 group had no statistical significance(P>0.05),while between the CIN3 group and the cervical cancer group had statistical significance(P<0.05),the higher the malignant degree,the higher the positive rate.The abnormal mutation rate of chromosome 3 number was 0% in the healthy group and the CIN1 group,16.7% in the CIN2 group,66.7% in the CIN3 group and 100.0% in the cervical cancer group,the positive rate in the CIN3 group and the cervical cancer group was significantly higher than that in the healthy group,CIN1 group and CIN2 group,the differences were statistically significant (P<0.05).ConclusionThe TERC abnormal gene expression,high risk HPV infection and mutation of chromosome 3 number could play an important synergistic effect during the process of occurrence and progression of cervical cancer.

Key words:cervical disease；human telomerase RNA component gene;human papilloma virus；chromosome 3；fluorescence in situ hybridization

(收稿日期：2015-11-05)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.015

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0326-03

作者簡介：李亞波，女，主治醫師，主要從事臨床檢驗研究。△通訊作者，E-mail:liyabo722@163.com。