漆黃素逆轉慢性應激鼠認知損害及其機制

涂傳龍，莊聰文，石曉磊，翁向群

(南京軍區福州總醫院僑賓科，福建 福州　350025)

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漆黃素逆轉慢性應激鼠認知損害及其機制

涂傳龍，莊聰文，石曉磊，翁向群

(南京軍區福州總醫院僑賓科，福建 福州350025)

摘要：目的探討漆黃素是否逆轉慢性束縛應激小鼠認知損害及其機制。方法用CD1小鼠建立慢性束縛應激模型，漆黃素(25 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥14 d。Morris水迷宮檢測空間學習記憶功能，Western blot檢測相關蛋白表達變化。結果漆黃素明顯改善應激鼠空間學習記憶功能，提高海馬細胞外信號調節激酶ERK磷酸化水平，同時增加突觸蛋白synapsin I、PSD95表達。ERK特異性阻斷劑U0126完全阻斷漆黃素改善認知。結論漆黃素改善慢性應激鼠認知功能，可能通過ERK通路調節神經可塑性有關。

關鍵詞：漆黃素；慢性束縛應激；Morris水迷宮；海馬組織

應激常激活下丘腦—垂體—腎上腺軸和提高應激激素，即糖皮質激素水平[1]。慢性應激常損害海馬依賴的學習記憶功能[2]。海馬與學習記憶功能密切相關，而其富含糖皮質激素受體，因此，海馬組織特別易感于糖皮質激素升高，糖皮質激素長期升高，比如慢性應激，常損害海馬組織結構，包括神經生化、興奮性、神經元形態，甚至神經元死亡[3-4]。因此，慢性應激常損害海馬依賴的學習記憶功能，比如Y-迷宮空間學習記憶[5]。漆黃素(3,3',4',7-四羥基黃酮)屬于黃酮類化合物，富含于草莓等水果、蔬菜，口服可透過血腦屏障[6]。已有研究發現漆黃素能夠抑制氧化應激導致的神經細胞死亡[7]，具有神經營養因子的活性[8]，易化海馬腦片長時程增強(long-term potentiation,LTP)[9]，改善阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)認知功能[10]。因此，既往這些研究表明漆黃素具有改善腦學習記憶功能。

漆黃素是否改善慢性應激導致的認知損害尚未見報道，我們前期的實驗發現慢性束縛應激導致認知損害，包括海馬依賴的依賴的空間學習記憶功能。為證實漆黃素是否改善慢性應激導致的認知損害，慢性應激鼠給予漆黃素，并觀察漆黃素是否改善認知功能，同時探討具體的細胞分子機制。

1材料與方法

1.1動物雄性CD1(ICR)小鼠8～10周齡，CD1小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2002-0003。動物飼養于環境溫度24～27℃，自由獲得食物和水，光照周期12 h。動物適應1周后才開始實驗處理。

1.2藥品及試劑漆黃素粉末購買于美國Sigma公司，純度≥98%，漆黃素溶解于5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續漆黃素灌胃(25 mg·kg-1) 14 d,對照組給予等體積5%羧甲基纖維素鈉溶液。U0126，ERK特異性阻斷劑，溶于50%二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，最終濃度為1 mg·L-1，漆黃素給藥前30 min雙側背側海馬微量注射U0126，每側注射量為0.5 μL，每天注射1次，連續給藥14 d。ERK抗體(cell signaling technology公司)、Phospho-ERK抗體(cell signaling technology公司)、Synapsin I抗體(Abcam公司)、PSD95抗體(Abcam公司)。

1.3慢性束縛應激CD1鼠塞于50 mL通風離心管，保持小鼠僅能呼吸運動，每天3 h，連續21 d，束縛應激結束后放回飼養籠。束縛應激期間對照鼠禁飲禁食3 h。

1.4Morris水迷宮實驗Morris水迷宮實驗據以往報道[11]，略作修改。迷宮置于空間信息豐富的實驗周圍環境，作為動物學習過程中的空間參照物，且整個實驗期間周圍環境信息固定不變。水迷宮均分為4個象限，將平臺置于其中一象限中央，作為實驗中動物逃離水環境的唯一途徑，保持平臺位置固定不變。選擇剩下的3個象限作為動物的入水點，動物面向池壁放入水中，每天訓練4次，分別從4個象限入水，且每天所有動物入水點的順序保持一致。訓練時間為60 s，動物放入水中，若動物在60 s內找到平臺，則尋平臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留15 s，以便動物觀察周圍環境。若動物在60 s內未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為60 s，并引導動物登陸平臺并使其在平臺上停留15 s。每天每只動物4次訓練的潛伏期、游泳路程、游泳速度的平均值，作為評價動物學習能力的指標。經過5 d的訓練學習，第6天撤去平臺，進行空間探索實驗。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測60 s內在原平臺象限的時間比，作為評價空間記憶能力的重要指標。

1.5突觸小體的準備與Western blot適量海馬組織加入勻漿液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES (pH 7.4)，1×蛋白酶抑制劑混合物)中勻漿，勻漿液1 000×g、4℃離心10 min，上層液12 000×g、4℃離心15 min，細胞碎片重新加入勻漿液(0.32 mol·L-1蔗糖，4 mmol·L-1HEPES (pH7.4)，1×蛋白酶抑制劑混合物)中勻漿，勻漿液12 000×g、4℃離心15min，突觸小體碎片加入溶液(50 mmol·L-1HEPES (pH7.4)，2 mmol·L-1EDTA，1×蛋白酶抑制劑混合物)，即為突觸小體蛋白提取物，檢測突觸膜蛋白表達變化。BCA法制作標準曲線，測定樣品總蛋白濃度。SDS-PAGE膠單孔上樣量20 μg總蛋白，恒壓(80～120 V)電泳，恒流250 mA電轉膜后封閉PVDF膜1 h，一抗4℃冰箱搖床孵育過夜，二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗脫3次后化學發光成像系統發光。

1.6腦立體定位及雙側套管安置取實驗用小鼠，稱重，用2%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為40 mg·kg-1。待小鼠完全麻醉后，將其固定在立體定位儀上，使其頭部固定并盡量保持水平。將針管對準前囟，以前囟為基點，按照需要定位的腦區坐標，在顱骨表面找到相應位置，做上記號。用鉆頭在記號處鉆孔，將針管按照定位坐標的深度插入到需要的腦區。用牙托粉固定套管。雙側背側海馬具體坐標如下：(前囟為基點)前囟向后1.8 mm，中線旁開1.4 mm，向下2.2 mm。套管安放好之后，小鼠需休息1周再展后續的實驗。

1.7數據統計與分析運用SPSS 20.0統計軟件進行資料分析。試驗觀測資料主要為計量數據，表示為多組間的比較，為單因素方差分析+LSD多重比較；重復測量的資料則行重復測量方差分析，其組間兩兩比較為成組t檢驗，時點間兩兩比較為差值t檢驗，并采用Bonferroni法進行顯著性水準的調整。

2結果

2.1漆黃素逆轉慢性束縛應激導致的認知減退Morris水迷宮實驗定向航行試驗及探索試驗結果見圖1。以單因素重復測量方差分析尋找平臺潛伏期資料，提示對照組、漆黃素+應激組訓練天數均有統計學意義(P<0.05)，而應激組訓練天數無統計學意義(P>0.05)。第1天各組小鼠尋找平臺潛伏期無顯著差異(P>0.05)，第2～5天定向航行學習，漆黃素可使應激鼠尋找平臺潛伏期明顯縮短(P<0.01)。探索試驗中，與對照組相比，應激組在目標象限時間百分比明顯減少(P<0.05)，而漆黃素延長應激鼠目標象限時間百分(P<0.05)。各組小鼠尋找平臺潛伏期差異可能由于小鼠游泳能力差異造成，統計學發現第1～5天各組小鼠平均游泳速度無顯著差異(P>0.05)，說明各組小鼠自發活動能力均正常，提示漆黃素逆轉慢性應激鼠空間認知損害。

圖1　漆黃素改善慢性束縛應激鼠

注：A.Morris水迷宮定向航行試驗逃離潛伏期；B.空間探索試驗平臺象限游泳時間百分比；與對照組對比，*P<0.05；與應激組相比，#P<0.05；C.代表性航行試驗軌跡圖(從左至右依次為對照組、應激組、應激+漆黃素組)。

2.2漆黃素提高慢性束縛應激鼠海馬突觸蛋白表達經單因素方差分析+兩兩比較：與對照組相比，應激組海馬突觸前蛋白Synapsin I和突觸后蛋白PSD95均表達減少(P<0.05)，慢性漆黃素處理逆轉兩種蛋白的減少(P<0.05)。突觸膜蛋白的表達變化，常提示突觸形態和數量改變,即神經可塑性的改變。見圖2。

圖2　漆黃素增加慢性束縛應激

注：A.western blot檢測海馬膜蛋白表達變化；B.相對蛋白條帶強度；與對照組對比，*P<0.05；與應激組相比，#P<0.05。

2.3抑制海馬ERK活性阻斷漆黃素改善認知功能經比較：與對照組相比，應激組海馬磷酸化ERK表達減少(P<0.05)。應激組與漆黃素+應激組海馬磷酸化ERK表達具有顯著差異(P<0.01)，因此,漆黃素逆轉應激導致的磷酸化ERK水平降低。各組總ERK表達差異無統計學意義(P>0.05)。考慮到漆黃素給藥后磷酸化ERK水平增高，可能漆黃素激活ERK通路發揮作用，為證實這一發現，漆黃素灌注口服前半小時海馬局部腦區微量注射ERK阻斷劑U0126，觀察兩者之間的關系。見圖3。Morris水迷宮檢測應激鼠空間學習記憶能力，第1天各組小鼠尋找平臺潛伏期無顯著差異(P>0.05)，第2～5天定向航行學習，漆黃素可使應激鼠尋找平臺潛伏期明顯縮短(P<0.01)，漆黃素+U0126組差異無統計學意義(P>0.05)。探索試驗中，雙向方差分析示漆黃素處理存在主效應(P<0.05)，漆黃素與U0126處理存在交互作用(P<0.05)，而U0126處理主效應無顯著差異(P>0.05)。統計學發現第1～5天各組小鼠平均游泳速度無顯著差異(P>0.05)，說明漆黃素、U0126均不影響小鼠自發活動。見圖4。

圖3　漆黃素提高慢性束縛應激

注：A.western blot檢測海馬磷酸化蛋白水平變化；B.相對蛋白條帶強度；與對照組對比，*P<0.05；與應激組相比，#P<0.05。

3討論

慢性應激常伴長期糖皮質激素增高，富含糖皮質激素受體的海馬結構易感于應激，而海馬是學習記憶的重要部位，因此，慢性應激可損害海馬依賴的學習記憶功能。慢性應激損害海馬的可能機制包括CA3區神經細胞重塑、突觸活性的抑制和海馬體積的縮小[12]。應激是不可避免的，并且會導致認知損害，本實驗發現慢性束縛應激損害海馬依賴的水迷宮空間學習與記憶能力，而慢性口服漆黃素可逆轉其改變。過量糖皮質激素或行為應激導致海馬錐體神經元樹突棘萎縮和退化，導致神經纖維網的稀疏[13]。長期過量糖皮質激素也可能導致海馬錐體神經元死亡[14]。慢性束縛應激導致海馬突觸膜蛋白表達減少，而漆黃素增加其表達。而突觸膜蛋白的表達增加常意味著突觸數量和密度的增加。既往研究發現漆黃素可激活神經細胞內的ERK通路[7]，且通過激活ERK發揮神經保護、神經營養因子活性和認知增強效應[9]，最近研究發現激活ERK通路是漆黃素發揮保護亨廷頓病模型PC12細胞所必需[15]，且是漆黃素改善阿爾茨海默病行為改變和減輕神經病理所必需[10]。本實驗發現慢性給予漆黃素后應激鼠海馬ERK磷酸化水平增高，為證實海馬ERK通路參與漆黃素改善應激導致的認知損害，海馬微注射ERK抑制劑U0126完全阻斷漆黃素改善認知，從而證實ERK通路參與漆黃素改善認知。總之，本實驗證實慢性束縛應激損傷海馬空間認知，而漆黃素改善慢性應激導致的認知損害，通過增加海馬突觸膜蛋白表達，且通過ERK通路改變神經可塑性來發揮改善認知功能。

圖4　ERK阻斷劑完全拮抗漆黃素改善慢性

注：A.Morris水迷宮定向航行試驗逃離潛伏期；B.空間探索試驗平臺象限游泳時間比；與應激組對比，*P<0.05。

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◇藥學研究◇

Fisetin reverses cognitive impairment provoked by chronic stress

and mechanism in mice

TU Chuan-long, ZHUANG Cong-wen, SHI Xiao-lei,et al

(FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou,Fujian350025,China)

Abstract:Objective To investigate whether fisetin treatment prevents cognitive deficits provoked by chronic stress and mechanism in mice.MethodsMice were subjected to chronic restraint stress for 21 days. Stressed mice received repeated gavage of 25 mg·kg-1fisetin once daily for 14 consecutive days. Morris water maze (MWM) task was conducted for evaluating hippocampus-associated learning and memory. The expression levels of proteins in the hippocampus of mice were analyzed by western blot. ResultsFisetin dramatically ameliorated the cognitive impairments in the stressed mice, rescued the decrease of hippocampal phospho-ERK level. Moreover, fisetin significantly improved synapse-associated proteins synapsin I and PSD95 expression. The ERK inhibitor, U0126, antagonize the fisetin-induced enhancement of cognitive function.ConclusionsFisetin improves cognitive deficits provoked by chronic stress in mice, which may attribute to ERK signaling pathway involved in the hippocampus.

Key words:fisetin;chronic restraint stress;Morris water maze;hippocampus

收稿日期：(2015-08-17，修回日期：2015-11-09)

通信作者：翁向群，女，副主任醫師，研究方向：老年病，E-mail：xqwengzj@163.com

基金項目：福建省自然科學基金面上項目(No 2009J01188)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.004