子宮內膜病變組織超氧化物歧化酶2的表達及臨床意義

周　鵬，陳向紅,朱　鵬

(1.安徽醫科大學公共衛生學院，安徽 合肥　230032；2.武警安徽省總隊醫院病理科，安徽 合肥　232041；

3.安徽醫科大學基礎醫學院病理教研室，安徽 合肥　230032)

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子宮內膜病變組織超氧化物歧化酶2的表達及臨床意義

周鵬1，2，陳向紅3,朱鵬1

(1.安徽醫科大學公共衛生學院，安徽 合肥230032；2.武警安徽省總隊醫院病理科，安徽 合肥232041；

3.安徽醫科大學基礎醫學院病理教研室，安徽 合肥230032)

摘要：目的研究女性子宮內膜正常和病變組織中的超氧化物歧化酶2(SOD2)的表達及其臨床意義。方法收集125例女性子宮內膜組織蠟塊，包括正常子宮內膜組織38例、子宮內膜簡單型增生20例、子宮內膜復雜型增生20例和子宮內膜樣腺癌47例，通過組織微陣列儀制備組織微陣列(TMA)蠟塊并進行切片，使用免疫組織化學(兩步法)檢測TMA中各組子宮內膜組織的SOD2表達情況。結果TMA切片中正常子宮內膜、子宮內膜簡單型增生、子宮內膜復雜型增生和子宮內膜樣癌組織的SOD2的高表達率分別為68.4%、 55.0%、45.0%和38.3%，各組間表達差異具有統計學意義(P<0.05)；子宮內膜樣腺癌組織中SOD2的表達分別與腫瘤組織學分級和腫瘤子宮肌層浸潤呈顯著負相關(均P<0.05)。結論SOD2基因表達下調導致的氧化應激加劇可能在女性子宮內膜樣腺癌發生發展過程中發揮了一定作用。

關鍵詞：子宮內膜癌；超氧化物歧化酶2；免疫組織化學

子宮內膜癌是中老年女性生殖系統最常見的惡性腫瘤類型之一，而子宮內膜樣腺癌占全部子宮內膜癌類型的80%～90%[1]。近年來，隨著臨床婦科診療技術有了一定的進展，針對早期子宮內膜癌患者的治療效果和臨床預后有了顯著的提高，但中晚期患者的治療效果、臨床預后和生活質量依然不佳[2]。因此，研究子宮內膜樣腺癌發生和發展的潛在分子機制，發掘參與其中的關鍵因子和通路并盡可能的進行相應干預，能夠對提高子宮內膜樣腺癌患者的早期診斷率、治療效果和改善患者預后有著重要意義。近年研究表明，活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)增多參與了多種人類常見惡性腫瘤的發生和發展[3]，而超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase, SOD2)基因編碼的錳超氧化物歧化酶(MnSOD)，是人體內最主要的超氧自由基清除劑，能夠保護體內正常細胞免受ROS損傷的作用。最新研究顯示，多種惡性腫瘤中SOD2表達較其相應的正常組織顯著下調，提示SOD2介導ROS可能參與了惡性腫瘤的發生演變過程[4]。然而，SOD2在臨床子宮內膜癌發生和發展中的角色和作用國內未見報道。本研究首先收集正常和不同癌前病變階段的子宮內膜以及子宮內膜樣腺癌組織，構建組織微陣列(Tissue microarray，TMA)蠟塊并進行切片，通過免疫組織化學技術檢測各組正常和病變子宮內膜組織中SOD2蛋白的表達，分析其在正常子宮內膜、不同癌前病變階段和癌變患者中表達及其與患者臨床病理特征的關系，探討SOD2在子宮內膜癌發生發展中的可能的角色和臨床意義。

1材料與方法

1.1病例資料收集武警安徽省總隊醫院和安徽醫科大學第一附屬醫院病理科檔案室石蠟包埋樣本125例，包括正常子宮內膜蠟塊38例、子宮內膜簡單型增生蠟塊20例、子宮內膜復雜型增生蠟塊20例和子宮內膜樣腺癌蠟塊47例。所有病例均由病理醫師復查蘇木素-尹紅(HE)切片，核對病理診斷。所有患者術前均未進行任何放療和化療。

1.2組織微陣列的制備首先收集每例樣本的HE染色切片，通過光學顯微鏡觀察選取合適蠟塊和具有代表性改變的區域，并且使用專用組織定位器在HE切片上進行顏色標記；然后根據該位點標記在原組織蠟塊上查找對應組織區域，確定組織取樣空心針的具體穿孔點；最后使用組織微陣列制備儀制備TMA蠟塊，其中每個組織點的直徑為1 mm，每個組織點的間距為1 mm，每個TMA含有7×8=56個組織點。在行免疫組織化學染色前，將TMA蠟塊以3 μm厚度連續切片，敷貼于免疫組織化學專用的防脫載玻片上。

1.3試劑與方法兔抗人SOD2多克隆抗體購自美國Abcam公司，羊抗兔兩部法免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒、抗原修復液和PBS緩沖液等均購自福州邁新生物技術公司。具體免疫組織化學染色步驟參照試劑說明書要求進行。實驗的陰性對照以PBS緩沖液代替一抗進行，按照說明書要求以人乳腺癌組織作為陽性對照。

1.4結果判定組織中SOD2染色以細胞質內出現黃色或棕黃色顆粒視為陽性，參照Fromowitz等[5]提出的以綜合染色強度和陽性細胞比例的染色標準進行評估，具體判定標準為：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(1+)，3～4分為中度陽性(2+)，5～6分為強陽性(3+)，其中2分以下視為SOD2低表達，3分以上視為SOD2高表達。

1.5統計學處理采用SPSS 10.0統計軟件進行統計學處理。樣本SOD2表達率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1SOD2在子宮內膜組織中表達和分布SOD2蛋白陽性信號呈黃色或棕黃色顆粒狀，主要定位于細胞漿，分布于正常子宮內膜腺體和腫瘤細胞，子宮內膜間質細胞也可見少量表達(圖1)。TMA切片中38例正常子宮內膜、20例簡單型增生、20例復雜型增生和47例子宮內膜樣癌組織的SOD2的高表達率分別為68.4%、 55.0%、45.0%和38.3%，各組間表達差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1　SOD2在正常子宮內膜(A)、

2.2SOD2表達狀況與子宮內膜癌臨床病理特征的關系為了進一步探討SOD2表達的臨床意義，本研究繼續分析了SOD2表達狀況與子宮內膜樣腺癌患者的臨床病理特征的相關性，由表1所示：組織學FIGO分級為I級的子宮內膜樣腺癌SOD2表達率為57.1%，顯著高于Ⅱ級和Ⅲ級的子宮內膜樣腺癌的表達率23.1%(P<0.05)；另外，無肌層浸潤的子宮內膜樣腺癌SOD2的表達率顯著高于有肌層浸潤的子宮內膜樣腺癌(83.3%和37.1%，P<0.05)。而子宮內膜樣腺癌SOD2表達狀況與患者年齡、腫瘤FIGO分期、腫瘤淋巴結轉移、腫瘤宮頸浸潤、腫瘤卵巢轉移和雌孕激素表達狀況均無統計學意義(均P>0.05)。

表1　子宮內膜樣腺癌SOD2表達與

3討論

在正常的生理狀況下，機體內ROS的產生與清除處于一種相對動態平衡的穩定狀態。當外源性的氧化刺激或內源性有害刺激作用于機體后，ROS量的這種穩定的狀態就會被打破，進而導致機體內ROS產生速度超過其抗氧化還原系統所能夠清除的范圍，從而機體內出現ROS過量沉積的狀態，引起體內出現氧化應激狀態。另一方面，SOD是機體內以氧為唯一底物的天然酶類清除劑和自由基連鎖反應的阻斷劑, 在保護細胞免受ROS的氧毒性損傷中發揮著重要作用。真核生物中SOD主要包括CuZnSOD和MnSOD兩種同工酶，其中SOD2 基因主要編碼MnSOD。近年研究發現，SOD2介導的ROS調控不僅在維持生理機能調控中發揮作用，在病理過程中，包括腫瘤的發生發展過程中也發揮了一定作用[6-7]。例如，Huang等[8]研究發現腫瘤細胞SOD2表達顯著下調，可以導致細胞內ROS沉積增多，而高濃度的ROS可以導致細胞DNA氧化損傷，從而引起細胞的增殖轉化和惡性腫瘤的發生。

子宮內膜癌是女性婦科最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐漸上升趨勢。在臨床腫瘤病理類型分類中，子宮內膜癌通常分為Ⅰ型和Ⅱ型[9]。子宮內膜癌I型主要為子宮內膜樣癌，是一種依賴雌激素類型的惡性腫瘤，該類型是最常見類型；而子宮內膜癌Ⅱ型相對罕見，為非雌激素依賴類型。研究顯示：子宮內膜樣腺癌的發病可能存在著從正常子宮內膜到簡單型增生、復雜型增生、到不典型增生，最后演變成癌的一系列發展趨勢。如果對該系列的子宮內膜病變進行連續性的動態觀察和研究，將有助于了解女性子宮內膜癌的發病過程和發病機制，并且可以幫助從該過程中發掘關鍵調控因子作為有效的生物學標志物，為子宮內膜癌的預防、早期發現、早期診斷乃至靶向治療提供有力的依據。為此，本研究收集了正常子宮內膜、子宮內膜簡單型增生、復雜型增生的不同癌前病變階段的子宮內膜和子宮內膜樣腺癌組織，觀察SOD2在該系列病變過程中的表達改變。

同時，為了保證研究結果的一致性和可比性，我們采用了TMA平臺行免疫組織化學檢測。TMA又稱組織芯片，是將數十個乃至數百個不同來源的組織樣本經過處理后，黏貼到同一張固相載體如玻璃載玻片或硅片上，形成高密度的切片[10]。TMA切片具有樣本量大、節省實驗時間、節約試劑和可比性高等優點，目前已成為臨床和基礎領域科學研究方法中的一大熱點[11]。本研究樣本量較大，為了減少不同批次和不同切片中免疫組織化學染色的人為操作的誤差，我們構建了TMA，然后通過免疫組織化學技術檢測了SOD2蛋白的表達，研究發現：SOD2在子宮內膜樣腺癌組織中表達強度顯著低于正常子宮內膜、子宮內膜簡單型增生和復雜型增生，并且在正常子宮內膜組織和子宮內膜癌前病變的簡單型增生和復雜性增生到癌變這個階段的組織中，SOD2表達呈逐漸下調的趨勢，提示SOD2的下調可能參與了子宮內膜癌的發病的一系列過程。進一步，本研究探討了子宮內膜樣腺癌中SOD2表達與患者臨床病理特征的關系，結果顯示腫瘤組織中SOD2表達狀況與腫瘤組織學分級和腫瘤子宮肌層浸潤均呈顯著負相關，提示SOD2表達的下調可能也參與了子宮內膜癌的惡性演進，即其發揮了一種抑癌基因的角色。體外研究發現，外源性上調細胞內源性SOD2的表達能夠通過氧化應激反應抑制人肺癌細胞株A549的增殖過程[12]。Liu等[13]采用免疫組織化學方法檢測了100例人舌鱗狀細胞癌的SOD2表達，發現其表達狀況與腫瘤淋巴結轉移呈顯著負相關，提示SOD2下調是舌癌進展的一個重要因素。國內張濟敏等[14]使用RT-PCR技術檢測了18例宮頸癌組織、20例宮頸上皮內瘤變和20例正常宮頸組織中SOD2的mRNA表達，發現宮頸癌SOD2的mRNA表達較正常上皮組織和上皮內瘤變組織顯著下調。類似的，王明臣等[15]同樣使用RT-PCR技術檢測了前列腺良惡性病變組織中SOD2 的mRNA表達，結果發現前列腺癌SOD2表達較良性前列腺增生顯著下調，這些結果與本研究均一致，提示SOD2可能在多種人類腫瘤中發揮了抑癌基因的角色。

總之，本研究通過TMA結合免疫組織化學技術，發現SOD2基因表達下調導致的氧化應激加劇可能在子宮內膜癌的發生發展過程中發揮了一定作用，其具體調控分子機制有待進一步研究。

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Expression and clinical significance of SOD2 in endometrial diseases

ZHOU Peng,CHEN Xiang-hong, ZHU Peng

(CollegeofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230032,China)

Abstract:Objective To explore the expression and clinical significance of SOD2 in endometrial diseases.Methods The expression of SOD2 protein was examined in 38 normal endometrial tissues (NE), 20 simple endometrial hyperplasia (SEH), 12 complex endometrial hyperplasia (CEH) and 47 uterine endometrial carcinoma (EC) tissues by two-step immunohistochemical method.ResultsThe high expression rate of SOD2 protein was 38.3% in EC, which was significantly lower than that in NE, SHE and CEH tissue(P<0.05). The expression of SOD2 was reversely correlated with tumor grade and tumor myometrial invasion (bothP<0.05). Conclusions SOD2 might play an important role in tumorgenesis and progression of EC.

Key words:endometrial carinoma;SOD2;immunohistochemistry

收稿日期：(2015-07-09,修回日期：2015-10-09)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.019