響應面優化超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖

呂雯姣，余兆碩，唐柳歡，嵇宏杰，彭彰文，吳竹青

（吉首大學食品科學研究所，湖南吉首416000）

響應面優化超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖

呂雯姣，余兆碩，唐柳歡，嵇宏杰，彭彰文，*吳竹青

（吉首大學食品科學研究所，湖南吉首416000）

以荸薺為原料，采用超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖，探討超聲波輔助條件下提取時間、提取溫度、α-淀粉酶添加量和料液比對荸薺多糖提取效果的影響；應用Box-Behnken設計四因素三水平試驗，依據響應面分析確定最優的提取工藝條件。結果表明，荸薺多糖最佳提取工藝參數為提取溫度56℃，提取時間47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，在此條件下荸薺多糖得率11.95%。

荸薺多糖；超聲波輔助；水酶法；工藝條件

荸薺（Eleocharis dulcis） 屬單子葉莎草科，主要生長于廣西、湖南等地的低洼地區。荸薺的藥理作用眾多，具有清熱解毒、涼血生津、利尿通便、化濕祛痰、消食除脹的功效。據研究報道，在荸薺中所含生物類多糖具有促進人體生長發育、加快體內三大物質（糖、脂肪、蛋白質）代謝、維持生理功能的需要、調節酸堿平衡等功能。

目前，用于荸薺多糖的提取分離方法主要有水提法、乙醇-水溶劑提取法、微波提取法和超聲波提取法。近年來，超聲波輔助水酶提取法由于提取溫度低、操作簡便、微量提取效率高、不破壞提取物結構等特點，已被廣泛用于天然植物有效成分的提取中[1]。

荸薺多糖的提取工藝受諸多因素影響，各因素間也存在著交互作用。因此，為了得出最優工藝條件，采用超聲波輔助水酶法通過單因素和響應面法分析優化試驗。對超聲波提取溫度和提取時間、料液比、酶添加量進行研究，獲得響應面法優化超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖的優化工藝[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

荸薺，購于吉首市農貿市場；α-淀粉酶（2 000 U/g）；葡萄糖、無水氯化鈣、苯酚、濃硫酸、正丁醇、三氯甲烷、95%乙醇，均為分析純試劑。

1.2 試驗儀器

722型分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；RE-501A型旋轉蒸發器，鄭州特爾儀器有限公司產品；101-2AB型電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產品；超聲波提取器；HH-S型恒溫水浴，江蘇金華市醫療儀器廠產品；FDS-series型真空冷凍干燥機，SIMInternational Group產品；LXJ-IIB型飛鴿牌離心機，上海愛奉機電設備有限公司產品。

1.3 荸薺多糖提取工藝流程

1.3.1 材料預處理

取200 g新鮮荸薺，洗凈、去皮，切成2～3 mm厚的薄片，于電熱恒溫鼓風干燥箱中65℃充分烘干，并用研缽粉碎。

1.3.2 工藝流程

荸薺→烘干粉碎、制液→超聲波水提→α-淀粉酶去淀粉→高溫滅活酶→離心→取上清液（粗提液）→Sevage法脫蛋白→萃取→取上清液→醇析→離心→取下層沉淀→真空冷凍干燥→粗荸薺多糖[3]。

1.4 荸薺多糖得率計算

荸薺多糖得率：

式中：Y——荸薺多糖質量；

m——荸薺多糖質量；

w——荸薺粉末質量。

1.5 試驗設計

1.5.1 單因素試驗

研究料液比、α-淀粉酶添加量、提取時間和提取溫度對荸薺多糖得率的影響，首先做單因素試驗考察以上條件對荸薺多糖得率的影響，然后采用響應面法優化最佳工藝條件，作為荸薺多糖提取指標。在不同料液比（1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18，1∶20），不同提取溫度（50，55，60，65，70℃），不同提取時間（25，30，35，40，45，50 min）和不同α-淀粉酶添加量（3.6×103U，4.0×103U，4.4× 103U，4.8×103U，5.2×103U）等條件下，考察各個因素對荸薺多糖得率的影響[4-5]。

1.5.2 響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，采用四因素三水平的Box-Behnken響應面試驗設計方法，以料液比、α-淀粉酶添加量、提取時間和提取溫度為考察因素，以荸薺多糖得率為指標進行優化[6]。

1.6 數據統計與分析

采用Design-Expert軟件（Version 7.1 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）對響應面試驗得到的數據進行線性回歸和方差分析，模型及因素的顯著性均通過F值考察（p＜0.05），所有試驗均需做3個重復[7]。

2 結果與討論

2.1 荸薺多糖提取單因素試驗

2.1.1 提取溫度對荸薺多糖得率的影響

提取溫度對荸薺多糖得率的影響見圖1。

由圖1可知，提取溫度為55℃時荸薺多糖得率最大。因為提取溫度低于55℃時，分子擴散運動小，物料的空化作用不夠完全，從而降低了得率；提取溫度高于55℃后，由于物料略有糊化，可能使得荸薺多糖得率降低，故選擇提取溫度為55℃。

圖1 提取溫度對荸薺多糖得率的影響

2.1.2 提取時間對荸薺多糖得率的影響

提取時間對荸薺多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對荸薺多糖得率的影響

由圖2可知，起初荸薺多糖得率隨提取時間的增加而增大，當超聲處理時間為45 min時達到最大值，之后隨提取時間的延長得率逐漸下降。由于超聲波作用在開始的時間內對細胞膜的破碎作用比較大，細胞溶出物多，得率不斷升高；當溶解度達到飽和時，有效成分不再被溶解，故提取時間選擇45 min。

2.1.3 料液比對荸薺多糖得率的影響

料液比對荸薺多糖得率的影響見圖3。

圖3 料液比對荸薺多糖得率的影響

由圖3可知，料液比由1∶10變化到1∶12時荸薺多糖得率逐漸增加，但料液比達到1∶16時得率下降，1∶14時達到最大。這是因為料液比1∶16時，溶液的黏度較大，影響分子擴散速率，使得體系分散不均勻，可能導致局部pH值過高，酶失去活性。

2.1.4 α-淀粉酶酶添加量對荸薺多糖得率的影響

α-淀粉酶添加量對荸薺多糖得率的影響見圖4。

由圖4可知，α-淀粉酶添加量為4.0×103U時荸薺多糖的得率增加迅速，其原因為加入酶制劑后，可以有效降解植物細胞壁的纖維素骨架，崩潰植物細胞壁，使細胞內有效成分釋出，從而提高了多糖得率；隨著α-淀粉酶添加量的進一步增加，酶解效果反而下降，其原因可能是酶的競爭性抑制作用，使提取的荸薺多糖分子與α-淀粉酶形成了復合體系，使酶的活力受到了抑制。因此，確定α-淀粉酶添加量為4.0×103U。

圖4 α-淀粉酶添加量對荸薺多糖得率的影響

2.2 響應面設計結果與分析

根據單因素試驗結果，設定提取溫度50～60℃，提取時間40～50 min，料液比1∶12～1∶16，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U，采用Box-Behnken響應面設計法來優化提取條件[8-10]。

Box-Behnken試驗設計因素與水平設計見表1，Box-Behnken試驗設計與結果見表2，回歸模型的方差分析見表3。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平設計

通過分析，可以得到荸薺多糖提取條件與荸薺多糖得率之間的二次多項式模型：

式中：Y——荸薺多糖得率的預測值；

X1——提取溫度的編碼值；

X2——提取時間的編碼值；

X3——料液比的編碼值；

X4——α-淀粉酶添加量的編碼值。

F檢驗反映的是回歸模型的有效性，包括失擬性檢驗和回歸方程顯著性檢驗。方差分析結果（表3）顯示，方程復相關系數的平方R2=0.969 0，說明該模型極顯著（p＜0.01），失擬項在0.05水平上不顯著；R2adj=0.932 9，說明建立的模型能夠解釋93.29%響應值的變化，能很好地描述超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖得率隨提取條件的變化規律。因此，該模型具有可行性。

由表3可知，因素X1，X2，X3，X4，X1X3，X2X4，X12，X22，X32，X42對荸薺多糖得率的影響極顯著（p＜0.01），X1X4，X3X4對荸薺多糖得率的影響較顯著（p＜0.05），X2X3，X1X2對荸薺多糖得率的影響不顯著（p＞0.05）。為了便于對模型進行分析討論，不顯著的項沒有去掉。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 回歸模型的方差分析

2.3 二因素間的交互作用分析

由方程（1）所作的響應面及等高線見圖5～圖8，各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過該組圖直觀反映出來。等高線的形狀反映了交互作用的強弱，橢圓表示兩兩交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。

2.3.1 提取溫度和料液比的交互作用分析

提取溫度與料液比響應面和等高線見圖5。

圖5 提取溫度與料液比響應面和等高線

由圖5可知，提取溫度和料液比的交互作用達極顯著水平，將提取時間和α-淀粉酶添加量固定在零水平，可以得到提取溫度和料液比對荸薺多糖得率影響的方程：

另可看出，隨著提取溫度和料液比的增加，荸薺多糖得率增加。但是，提取溫度過高、料液比過大都不利于荸薺多糖的析出。所以，提取溫度56℃，料液比1∶12～1∶14時，荸薺多糖得率最高。

2.3.2 提取溫度和酶添加量的交互作用分析

提取溫度與α-淀粉酶添加量響應面和等高線見圖6。

由圖6可知，提取溫度和酶添加量的交互作用達顯著水平，將提取時間和料液比固定在零水平，可以得到提取溫度和α-淀粉酶添加量對荸薺多糖得率影響的方程：

圖6 提取溫度與酶添加量響應面和等高線

另可看出，隨著提取溫度和酶添加量的增加，荸薺多糖得率增加。但是，提取溫度過高，α-淀粉酶添加量過大都不利于荸薺多糖的析出。所以，提取溫度56℃，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U時，荸薺多糖得率最高。

2.3.3 提取時間和酶添加量的交互作用分析

提取時間與酶添加量響應面和等高線見圖7。

圖7 提取時間與α-淀粉酶添加量響應面和等高線

由圖7可知，提取時間和α-淀粉酶添加量的交互作用達極顯著水平，將提取溫度和料液比固定在零水平，可以得到提取時間和α-淀粉酶添加量對荸薺多糖得率影響的方程：

隨著提取時間和α-淀粉酶添加量的增加，荸薺多糖得率增加。但是，提取時間過長，α-淀粉酶添加量過大都不利于多糖的析出。所以，提取時間46～47 min，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U時，荸薺多糖得率最高。

2.3.4 料液比和酶添加量的交互作用分析

料液比與α-淀粉酶添加量響應面和等高線見圖8。

圖8 料液比與α-淀粉酶添加量響應面和等高線

由圖8可知，料液比和α-淀粉酶添加量的交互作用達顯著水平，將提取溫度和提取時間固定在零水平，可以得到料液比和α-淀粉酶添加量對荸薺多糖得率影響的方程：

另可看出，隨著料液比和酶添加量的增加，荸薺多糖得率增加。但是，料液比過大，α-淀粉酶添加量過大都不利于荸薺多糖的析出。所以提取時間46～47 min，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U時，荸薺多糖得率最高。

2.4 模型的優化和驗證

通過分析可以得到最佳的提取條件為提取溫度56.37℃，提取時間47.38 min，料液比1∶13.66，酶添加量4.4×103U，荸薺多糖得率可達12.35%。根據實際情況，選擇提取溫度56℃，提取時間47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，測定荸薺多糖得率為11.95%，與預測值接近，說明該模型可以較好地預測超聲波輔助水酶法提取條件與荸薺多糖得率之間的關系，同時也證明了響應面法優化荸薺多糖提取工藝參數的可行性。

3 結論

通過單因素試驗考察了提取溫度和提取時間、料液比、酶添加量對荸薺多糖得率的影響，將提取溫度考查范圍定為50～60℃、提取時間考查范圍定為40～50 min、料液比考查范圍定為1∶12～1∶14、α-淀粉酶添加量的考查范圍定為4.0×103～4.8× 103U，通過響應面法分析，建立了超聲輔助水酶法提取荸薺多糖得率數學模型回歸方程的決定系數0.969 0，方程顯著，擬合良好，可以進行實際預測。應用響應面設計法優化出其最佳超聲提取條件為提取溫度56℃，提取時間47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，最高得率為11.95%，為地區工業化利用豐富的荸薺資源、提取多糖提供了生產數據。同時，采用超聲法輔助水酶法從荸薺中提取多糖成分的方法提取速度快，容易實現產業化，具有一定的地區經濟價值。

[1]景榮琴，熊清平，景怡.響應面法優化桑葚多糖的超聲波輔助提取工藝條件 [J].天然產物與開發，2014（4）：570-574.

[2]吉仙枝.超聲波協同α-淀粉酶提取野生山藥多糖工藝研究 [J].三門峽職業技術學院學報，2015，14（1）：140-144.

[3]張吉祥，歐來良.正交試驗法優化超聲提取棗核總黃酮 [J].食品科學，2012，33（4）：18-21.

[4]高清雅，趙保堂，尚永強，等.超聲波協同復合酶提取蘭州百合多糖 [J].食品與發酵工業，2014，40（8）：263-267.

[5]楊建剛，王文亮，王世清，等.超聲波輔助酶法提取洋蔥多糖的工藝研究 [J].食品工業，2015，36（1）：37-40.

[6]申迎賓，范子劍，麻浩.響應面法優化發芽豇豆積累γ-氨基丁酸工藝條件的研究 [J].食品科學，2010，31（2）：10-16.

[7]逯與運，麻成金，黃群，等.響應面優化超聲波輔助水酶法提取蠟梅籽蛋白 [J].中國食物與營養，2010（9）：59-63.

[8]許子競，黎貴卿，黃麗，等.響應面法優化微波輔助提取滇桂艾納香多糖工藝研究 [J].食品工業科技，2010（1）：220-223.

[9]趙華，張慧明，董銀卯，等.銀杏葉黃酮類化合物水提工藝的響應面優化 [J].北京工商大學學報，2010，28（3）：27-43.

[10]Shi Yun-lai，Chen Chao.Optimal design of butterflyshaped linear ultrasonic motor using finite element method and response surface methodology[J].Journal of Central South University，2013，20：393-404.◇

Optimization of Eleocharis Dulcis Polysaccharides Extraction with Ultrasonic Assistant Aqueous Enzymatic by Response Surface Methodology

LV Wenjiao，YU Zhaoshuo，TANG Liuhuan，JI Hongjie，PENG Zhangwen，*WU Zhuqing
（Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

The effects of ultrasonic-assisted time and temperature，enzyme dosage and ratio of material to liquid on the extraction rate of Eleocharis dulcis polysaccharides are studied with the polysaccharides extracted by the ultrasonic wave-assisted aqueous enzymatic methed.Box-Behnken design with 4 factors and 3 levels test is applied in this experiment，while the optimal process conditions are obtained by regression analysis of response surface methodology.The results show that the optimal extraction conditions are as follows：ultrasonic temperature 56℃，ultrasonic time 47 min，material-water ratio 1∶14，enzyme dosage 4.4×103U.In this optimal process condition，the yield of eleocharis dulcis polysaccharides is 11.95%.

Eleocharis dulcis polysaccharides；ultrasonic assistant；aqueous enzymatic method；technological parameter

TS255.36

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.001

1671-9646（2016）12a-0001-05

2016-09-08

吉首大學2014年大學生創新性實驗項目（2014ZXCX09）。

呂雯姣（1994— ），女，在讀本科，研究方向為植物資源研究與利用。

*通訊作者：吳竹青（1964— ），女，本科，高級工程師，研究方向為植物資源研究與利用。