卵母細胞成熟率與ICSI臨床結局的關系分析

劉輝，吳克良，趙海濱，李梅，李城，于官令

(山東大學附屬生殖醫院，濟南　250021)

?

卵母細胞成熟率與ICSI臨床結局的關系分析

劉輝，吳克良*，趙海濱，李梅，李城，于官令

(山東大學附屬生殖醫院，濟南250021)

【摘要】目的探討卵母細胞成熟率與卵胞漿內單精子注射(ICSI)臨床結局的關系。方法回顧性分析2014 年1～12月在本中心接受ICSI治療且獲卵數≥5枚、卵母細胞成熟率≥30%的2 196個周期，根據卵母細胞成熟率不同，分為5 組：A組：30%≤卵母細胞成熟率<60%；B組：60%≤卵母細胞成熟率<70%；C組：70%≤卵母細胞成熟率<80%；D組：80%≤卵母細胞成熟率<90%；E組：卵母細胞成熟率≥90%。比較5組間的受精率、卵裂率、優質胚胎率、胚胎種植率、放棄周期率及臨床妊娠率等。結果(1)各組基本資料比較，無顯著性差異(P>0.05)；(2)受精率：A組(71.11%)顯著低于C組(75.38%)、D組(77.40%)和E組(79.66%)，且 E組顯著高于其他4組(P<0.05)；(3)卵裂率：A組(97.93%)顯著低于D組(99.06%)和E組(99.13%)(P<0.05)；(4)周期取消率：A組(12.20%)顯著高于C組(5.61%)、D組(3.57%)和E組(3.07%)，B組(8.02%)顯著高于D組和E組，C組顯著高于E組(P均<0.05)；(5)胚胎種植率：A組(36.71%)顯著低于D組(48.80%)(P<0.05)；(6)其余觀察指標各組間比較均無顯著性差異(P>0.05)。結論卵母細胞成熟率較低時ICSI助孕的臨床結局相對較差。卵母細胞成熟率低于70%時臨床妊娠率開始下降，當卵母細胞成熟率低于60%時臨床妊娠率進一步降低。

【關鍵詞】卵胞漿內單精子注射；卵母細胞成熟率；臨床結局

(JReprodMed2016，25(2)：129-134)

控制性超促排卵(COH)可以使患者在同一周期產生多個卵母細胞，但普遍存在著卵母細胞發育不同步的現象[1]。當不成熟卵母細胞占的比例較多時，其ICSI助孕結局是否存在差異，為探討二者之間的關系，本研究分別對不同卵母細胞成熟率的卵胞漿內單精子注射(ICSI)助孕結局進行比較。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧分析2014年1～12月在本院接受ICSI 治療且獲卵數≥5枚的患者2 196個周期，為了盡量減少一些特殊患者對試驗結果的影響，將卵母細胞成熟率嚴重低下(成熟率<30%的患者)可能為卵母細胞成熟障礙的患者排除本試驗。本試驗中所使用精子來源均為手淫取精或者附睪/睪丸穿刺。根據卵母細胞的成熟率(成熟卵母細胞數/獲卵數)不同，分為 5 組：A組：30%≤卵母細胞成熟率<60%；B組：60%≤卵母細胞成熟率<70%；C組：70%≤卵母細胞成熟率<80%；D組：80%≤卵母細胞成熟率<90%；E組：90%≤卵母細胞成熟率。

二、研究方法

1. 促排卵方案：本試驗所選擇的患者均采用長方案，從黃體中期開始每日皮下注射短效GnRH-a(達必佳，0.1 mg/支，輝凌藥業，德國)0.05～0.1 mg直至HCG日，14～18 d后垂體達到降調節時[LH<5 U/L，E2<50 pg/ml(183 pmol/L)，內膜<4～5 mm，無功能性囊腫]，根據患者年齡、基礎FSH、LH水平、基礎竇卵泡數及體重等因素，開始使用一定劑量的外源性促性腺激素(Gn)，包括r-FSH(果納芬，默克雪蘭諾，德國，或普麗康，默沙東，荷蘭)和/或HMG(珠海麗珠制藥)行促排卵治療，根據陰道超聲監測的卵泡發育情況及血清性激素水平調整Gn用量，當主導卵泡直徑>20 mm或3個主導卵泡直徑≥18 mm時，給予人絨毛膜促性腺激素(HCG)(珠海麗珠制藥)4 000～8 000 U誘發排卵，HCG后36 h行B超引導下經陰道穿刺取卵術。

2. ICSI操作：將獲得的卵母細胞體外培養3～6 h，在透明質酸酶(hyaluronidase，80 U/ml)中將卵母細胞周圍的卵丘細胞脫去，然后將卵母細胞在顯微操作儀下進行ICSI 操作，注射16～20 h后觀察受精情況，在第2天(D2)、D3、D5、D6分別觀察胚胎發育情況。

3. 胚胎評分：參考Puissant的早期胚胎評分標準：(1)4分：卵裂球形態大小正常均一，無核碎片；(2)3分：卵裂球形態大小輕微不均，無核碎片或核碎片<細胞團塊的1/3；(3)2分：卵裂球大小不均，碎片介于細胞團塊的1/3～1/2；(4)1分：只有1或2個卵裂球，大量無核碎片；(5)0分：卵裂球退化，完全是碎片。優質胚胎是指由正常受精卵發育而來，且符合以下條件：(1)D2觀察到3～5個卵裂球，卵裂球沒有多核，評分3～4分的胚胎；(2)D3觀察到7～10個卵裂球，卵裂球沒有多核，評分3～4分的胚胎[2]。

4. 胚胎移植：根據患者的激素水平和子宮內膜情況決定是否新鮮周期移植，本試驗中所有的移植周期均為D3移植；周期取消的因素主要包括：卵母細胞全部未受精周期、全部為異常受精胚胎周期、受精卵全部未分裂周期、D3胚胎較差繼續培養后既無可移植胚胎又無可冷凍胚胎周期。

5. 隨訪：胚胎移植后給予黃體酮行常規黃體支持，2周后檢測血清HCG水平，確定是否妊娠，HCG陽性者為生化妊娠；移植后4～5周行B超檢查，見孕囊及原始心管搏動者診斷為臨床妊娠。

三、統計學處理

結果

一、各組患者一般資料、促排及胚胎移植情況比較

各組間平均年齡、平均助孕次數以及精子來源比較均無統計學差異(P>0.05)。各組間平均獲卵數比較亦無顯著性差異(P>0.05)；隨著卵母細胞成熟率的降低受精率逐步降低，A組低于C組(P<0.05)，A組顯著低于D組、E組(P<0.01)，E組顯著高于B組、C組、D組(P<0.01)；A組的卵裂率低于D組和E組(P<0.05)；優質胚胎率各組間比較無顯著性差異(P>0.05)；隨著卵母細胞成熟率的降低周期取消率逐步升高，A組高于C組(P<0.05)，A組顯著高于D組、E組(P<0.01)，B組高于D組(P<0.05)，B組顯著高于E組(P<0.01)，C組高于E組(P<0.05)(表1)。

表1　各組患者一般資料、促排及胚胎移植情況比較 [(x-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05，**P<0.01；與B組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與C組比較，#P<0.05；與E組比較，▲P<0.01

二、各組行D3鮮胚移植周期的各項參數比較

對各組行新鮮胚胎移植的周期進行統計學分析，比較其一般資料、胚胎移植及妊娠結局情況，結果顯示：各組間的平均年齡、平均助孕次數、平均獲卵數、平均移植胚胎數和移植優質胚胎率比較，均無統計學差異(P>0.05)；A組和B組的臨床妊娠率有低于C組、D組、E組的趨勢，但無統計學差異(P>0.05)；A組和B組的胚胎種植率也略低于C組、D組、E組，其中A組與D組比較有統計學差異(P<0.05)(表2)。

表2　各組行鮮胚移植周期的參數比較[(x-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05

討論

隨著輔助生殖技術的不斷發展，卵母細胞成熟率成為衡量促排卵效果的一項重要指標，越來越受到生殖領域醫生的重視。Bar-Ami等[3]的研究發現，當不成熟卵母細胞率>25%時，受精率和臨床妊娠率就會明顯下降，本研究結果與其發現基本一致。本文通過各組間臨床結局的對比發現，隨著卵母細胞成熟率的下降，受精率和優質胚胎率都隨之下降，尤其是受精率的下降極其明顯，而且當卵母細胞成熟率低于60%時，卵裂率也會隨之下降，這與王錦鳳等[4]的研究結果相似；且周期取消率也隨著卵母細胞成熟率的降低出現較為顯著的增加。當卵母細胞成熟率低于70%時臨床妊娠率開始下降，卵母細胞成熟低于60%時臨床妊娠率明顯降低。因此，我們應該高度重視低卵母細胞成熟率與ICSI助孕治療臨床結局之間的關系，盡可能地提高ICSI周期中的卵母細胞成熟率，以期獲得較好的臨床結局。

COH是整個輔助生殖過程中尤為重要的一個環節，促排卵效果的好壞直接影響所獲得卵母細胞的質量，進而影響整個助孕治療的臨床結局。COH包括卵泡的募集、發育、排卵的過程，其過程通常是不完全同步的，只有克服不同步的因素才有可能獲得質量與自然周期主導卵泡一樣的優質卵母細胞[5]。本研究中，卵母細胞成熟率較低的組別很可能是因為其COH方案不太理想，導致了大量的卵泡發育不同步，從而影響了卵母細胞質量、受精率、卵裂率和最終的臨床結局。

人類卵巢中存在成熟與未成熟階段的卵母細胞，絕大多數卵母細胞處于GV期。在激素等促排卵因素的刺激下，生發泡破裂(GVBD)，第一極體(Pb1)排出，進入MⅡ期，成為成熟卵母細胞。從GV期到MⅡ期的過程即“卵母細胞成熟”。卵母細胞成熟經歷了核成熟和細胞質成熟，這其中包括了一系列復雜、有序的細胞核與細胞質事件。核成熟包括生發泡破裂和減數分裂，染色體組裝到紡錘體上并向細胞外周移動，完成第1次減數分裂，被少量細胞質包圍的一套同源染色體作為Pb1排出，另一套遺傳物質則留在細胞質中并進入第2次減數分裂中期，卵母細胞從卵泡中排出。細胞質成熟則涉及到細胞器重組、Ca2+儲備增加、抗氧化劑升高、mRNA和蛋白質貯存等諸多事件[6]，且細胞質的成熟度與后續的胚胎發育密切相關。通常所說的卵母細胞成熟一般是指核成熟，但在COH過程中，外源性的Gn可導致卵母細胞代謝異常、三磷酸腺苷(ATP)含量下降、轉錄異常、不同步的核/質成熟[7]。只有胞漿成熟的卵母細胞才能實現卵裂球發育的同步化，促進胚胎發育，成為優質胚胎[8-10]。因此，低卵母細胞成熟率周期中成熟卵母細胞的受精率和優胚率都比較低，極有可能是由于細胞核與細胞質的不同步導致的。

卵母細胞成熟率低分為兩種情況，偶然產生的不成熟卵母細胞和反復發生的卵母細胞成熟障礙，卵母細胞成熟障礙特指獲得的卵母細胞中大部分為不成熟卵，卵母細胞成熟障礙有時甚至是完全性的，即無成熟卵母細胞產生。目前，對于完全的卵母細胞成熟障礙患者，接受供卵是唯一的治療途徑[11]。本研究中將卵母細胞成熟率低于30%的患者排除，以避免對試驗結局的影響。臨床上，大多數的低卵母細胞成熟率現象都是偶然產生的，若能夠找出影響卵母細胞成熟率的因素，即可以對ICSI中卵母細胞的成熟率進行改善。于康等[12]的研究發現，卵泡液中適量的雌激素(E2)和孕酮(P)可以促進卵母細胞的成熟，當卵泡液中10≤P/E2≤30時卵母細胞成熟率最高。Raziel等[13]的研究認為對COH過程中既往未成熟卵較多的患者，適當延長HCG注射至取卵的時間對提高胚胎質量和妊娠率有一定幫助；陳媛媛等[14]的研究亦發現，HCG注射后取卵時間對卵母細胞成熟率有一定影響，注射HCG后35.0～35.5 h取卵，獲得卵母細胞的成熟率將顯著低于HCG后35.6～36.5 h取卵的患者；還有研究者認為：體外培養時，自體顆粒細胞的存在對于卵母細胞的成熟是有利的[15]，宮立國等[16]的研究發現，延遲ICSI操作中脫去顆粒細胞的時間可以提高卵母細胞的成熟率，但是其差異不顯著；李軼等[17]的研究發現，成熟卵泡比例與注射HCG的時機對卵母細胞的成熟率有影響，當HCG日成熟卵泡(≥18 mm)比例≤20%時，其卵母細胞成熟率顯著低于成熟卵泡比例>20%的患者。因此，在輔助生殖過程中眾多因素都可能影響到卵母細胞的成熟率問題。

在COH過程中，應該高度重視低卵母細胞成熟率對臨床結局的影響，通過對既往病史的分析和血清激素水平的測定，把握好Gn用量以及HCG注射時機，及時調整臨床用藥方案[18]，盡量減少低卵母細胞成熟率的發生，對獲得發育同步的高質量卵母細胞，進而獲得較好的臨床結局尤為重要。而在獲卵過程中，可以通過對卵丘復合物觀察，當發現卵母細胞可能存在成熟率較低時，適當延遲脫顆粒的時間可能有助于最后的助孕結局。有動物實驗研究顯示，5%O2環境比20%O2更有利于未成熟卵體外成熟和胚胎發育[19]，提示可以通過將卵丘復合物放入低氧環境中培養以期獲得更高的卵母細胞成熟率。體內成熟卵母細胞排卵后至到達輸卵管壺腹部開始受精，期間所經歷的時間大約為4～6 h，即正常的受精時間應該是卵母細胞成熟后的4～6 h，而卵母細胞成熟率較低的患者可能是由于部分卵母細胞還不具備受精能力，導致受精率的下降，因此可能可以通過推遲ICSI受精時間來提高受精率；而對于已經出現的卵母細胞成熟率極低的情況，可以將未成熟的卵母細胞通過體外培養技術(IVM)聯合ICSI的方式獲得胚胎，也許可以獲得較好的累積妊娠率。

綜上所述，卵母細胞成熟率較低時ICSI助孕結局相對較差，卵母細胞成熟率低于70%時臨床妊娠率開始下降，當卵母細胞成熟率低于60%時臨床妊娠率進一步降低。因此，臨床上應對ICSI周期中的低卵母細胞成熟率情況引起高度重視，并綜合評估各方面情況以采取積極措施予以調整，以期改善其臨床結局。

【參考文獻】類型標識：根據GB3469規定，在文題后標識參考文獻類型。專著[M]，論文集[C]，報紙文章[N]，期刊文章[J]，網絡期刊文章[J/OL],學位論文[D]，報告[R]，標準[S]，專利[P]。對于專著、論文集中析出文獻，采用字母[A]；其他未說明的文獻采用[Z]。

[1]鄭屹，張歡，林佳，等. 兩側卵巢獲卵數差異率與體外受精-胚胎移植結局的關系 [J]. 生殖醫學雜志，2015，24：26-31.

[2]Puissant F，Van Rysselberge M，Barlow P，et al. Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment [J]. Hum Reprod，1987，2：705-708.

[3]Bar-Ami S，Zlotkin E，Brandes JM，et al. Failure of meiotic competence in human oocytes [J]. Biol Reprod，1994，50：1100-1107.

[4]王錦鳳，肖露，錢衛平，等. 發育不同步且未行穿刺的大卵泡在取卵日有無卵母細胞對IVF-ET結局的影響 [J]. 生殖醫學雜志，2015，24：520-524.

[5]莊廣倫. 高質量卵子從何談起 [J]. 生殖醫學雜志，2011，20：81-82.

[6]湯江靜，尹萍，邵敬於，等. 卵子線粒體老化——輔助生殖技術面臨的瓶頸 [J]. 生殖與避孕，2013，33：255-260.

[7]張媛媛，向卉芬，謝鑫，等. 卵胞質內單精子顯微注射后異常受精的影響因素分析 [J]. 生殖與避孕，2012，32：814-818.

[8]Wang LY，Wang DH，Zou XY，et al.Mitochondrial functions on oocytes and preimplantation embryos [J]. J Zhejiang Univ Sci B，2009，10：483-492.

[9]Hsieh RH，Au HK，Yeh TS，et al.Decreased expression of mitochondrial genes in human unfertilized oocytes and arrested embryos [J]. Fertil Steril，2004，81(Suppl 1)：912-918.

[10]孔令紅，劉忠，李紅，等. 自體顆粒細胞線粒體移植對胚胎發育質量的影響 [J]. 中華婦產科雜志，2004，39：105-107.

[11]王俊超. 卵子成熟障礙綜合征的特征及分子機制 [J]. 生殖與避孕，2014，34：778-782.

[12]于康，王曉燕，張玉，等. 卵泡液中血管內皮生長子和甾體激素水平對卵母細胞成熟和受精的影響 [J].生殖醫學雜志，2011，20：18-22.

[13]Raziel A，Schachter M，Strassburger D，et al.In vivo maturation of oocytes by extending the interval between human chorionic gonadotropin administration and oocyte retrieval [J]. Fertil Steril，2006，86：583-587.

[14]陳媛媛，劉蘭蘭，蔡嘉力，等. 人絨毛膜促性腺激素注射后取卵時間對卵子及胚胎質量的影響 [J]. 臨床軍醫雜志，2014，42：721-725.

[15]Johnson JE，Higdon HL，Boone WR，et al. Effect of human granulosa cell co-culture using standard culture media on the maturation and fertilization potential of immature human oocytes [J]. Fertil Steril，2008，90：1674-1679.

[16]宮立國，王維華，Inderbir Gill. ICSI操作中拆卵時間對胚胎質量及妊娠結局的影響 [J]. 中國優生與遺傳雜志，2011，19：113-114.

[17]李軼，李瑞岐，區頌邦，等. 成熟卵泡比例與注射時機的選擇及對卵子發育潛能的影響 [J]. 中山大學學報(醫學科學版)，2014，35：552-558.

[18]方小武，吳日然，徐建亞，等. 常規IVF受精失敗或受精低下相關因素分析 [J]. 中國優生與遺傳雜志，2012，20：112-113.

[19]Pereira MM，Machado MA，Costa FQ，et al. Effect of oxygen tension and serum during IVM on developmental competence of bovine oocytes [J]. Reprod Fertil，2010，22：1074-1082.

[編輯：谷炤]

本刊有關書寫數字、統計學符號和參考文獻須知

1.數字：執行國家標準GB/T15835-1995《關于出版物上數字用法的規定》。公歷世紀、年代、年、月、日、時刻和計數、計量均用阿拉伯數字。小數點前或后如超過4位數字時，每3位數字為一節，如1 329.476 5。但序數詞和年份、頁數、部隊番號、儀表型號、標準號不分節。百分數的范圍和偏差，前1個數字的百分符號不能省略，如：5%～95%不要寫成5～95%，(50.2±0.6) cm不要寫成50.2±0.6 cm。附有長度單位的數值相乘時，按下列方式書寫成：4 cm×3 cm×5 cm，而不寫成4×3×5 cm3。

3.參考文獻：應為最新文獻，不宜超過5年，內部資料及尚未發表者請勿列入。參考文獻的編號按照正文中出現的先后順序連續排列，一律用阿拉伯數字(外加方括號)表示。參考文獻書寫格式：

期刊：作者(參考文獻中的作者1～3名全部列出，多于3名時只列前3名，然后加“等”字，姓名間用逗號隔開)。文題[J]，刊名[中文期刊用全名，西文刊按《醫學文獻索引》(Index Medicus)格式縮寫]，年份，卷號(無卷號者只寫期號，外加圓括號)，起頁-止頁。

例：[1]來可如，陳湫波.金塑混合環等三種宮內節育器比較性研究[J].生殖與避孕，1991，11：46-54.

[2]Wetzeis A， Baotiaans BA, Goverde HJM, et al. Vero cells stimulate lumen sperm motaliy in vitro[J]. Fertil Steril,1991,56:535-539.

書籍：主編者.(或作者.文題[A].見：主編者)書名[M].版次.卷次.出版地：出版者，年份：起頁-止頁.

例：[1]王淑貞 主編.婦產科理論與實踐[M].上海：科學技術出版社，1981：68-79.

[2]Samsioe GN, Mattsson LA. Regimens for today and the future[A]. In:Rogerio AL(ed). Treatment of the post-menopausal woman[M]. New York:Raven Press,1994：373-383.

本刊編輯部

Relationship between oocyte maturation rate and clinical outcome of ICSI

LIUHui，WUKe-liang*，ZHAOHai-bin，LIMei，LICheng，YUGuan-ling

ReproductionHospitalAffiliatedtoShandongUniversity，Jinan250021

【Abstract】

Objective： To explore the relationship between oocyte maturation rate and clinical outcome of ICSI.

Methods： A total of 2 196 infertile patients undergone ICSI treatment，whose number of oocytes retrieved≥5 and maturation oocyte rate≥30% in our IVF center from Jan. 2014 to Dec. 2014 were included in this study.The patients were divided into five groups according to different oocyte maturation rate：group A with≥30% &<60%，group B with≥60% &<70%，group C with≥70% &<80%，group D with≥80% &<90%，group E with≥90%. The clinical outcomes including fertilization rate，cleavage rate，good quality embryo rate，implantation rate，cancellation cycle rate，and clinical pregnancy rate were compared among the five groups.

Results： There were no differences in basic information among the five groups (P>0.05). The fertilization rate of group A (71.11%) was significantly lower than that of group C (75.38%)，group D (77.40%) and group E (79.66%)，and group E was very significantly higher than the other four groups (P<0.05). The cleavage rate of group A (97.93%) was significantly lower than that of group D (99.06%) or group E (99.13%) (P<0.05). The cancellation cycle rate of group A (12.20%) was significantly higher than that of group C (5.61%)，group D (3.57%) and group E (3.07%) (P<0.01). The cancellation cycle rate of group B (8.02%) was significantly higher than that of group D and E (P<0.05)，and group C was significantly higher than group E (P<0.05). The implantation rate of group A (36.71%) were significantly lower than group D (48.80%)(P<0.05). There were no statistical differences in other clinical outcomes among five groups (P>0.05).

Conclusions： Clinical outcome of ICSI would be affected by low oocyte maturation rate. The clinical pregnancy rate start to decrease when the oocyte maturation rate is less than 70%，and the clinical pregnancy rate further decrease when the oocyte maturation rate is less than 60%.

Key words：ICSI；Oocyte maturation rate；Clinical outcomes

【作者簡介】劉輝，男，山東人，碩士，實驗師，生殖醫學專業.(*通訊作者)

【基金項目】衛生公益性行業科研專項(201402004)

【收稿日期】2015-08-17；【修回日期】2015-09-21

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.005