妊娠大鼠胚胎著床后短暫抑制體內雌激素合成對分娩的影響

苑鳳，武斌，賀斌，徐祥波，暴國，張樹成，王介東

(1. 北京協和醫學院研究生院，北京　100730；2. 國家衛生計生委科學技術研究所，北京　100081；3. 濟南市中心醫院，濟南　250013)

?

·實驗研究·

妊娠大鼠胚胎著床后短暫抑制體內雌激素合成對分娩的影響

苑鳳1，2，武斌3，賀斌2*，徐祥波2，暴國2，張樹成2，王介東2*

(1. 北京協和醫學院研究生院，北京100730；2. 國家衛生計生委科學技術研究所，北京100081；3. 濟南市中心醫院，濟南250013)

【摘要】目的研究大鼠胚胎著床后短暫抑制雌激素合成對分娩結局的影響。方法大鼠胚胎著床后GD 6.5～8.5給予雌激素抑制劑來曲唑灌胃(實驗組)或溶媒灌胃(對照組)，觀察其對胎兒發育和分娩結局的影響。結果實驗組和對照組的窩仔數和胎(仔)鼠重量比較無統計學差異(P>0.05)；實驗組孕鼠在GD 22.5均不能正常分娩，在GD 23.5體力衰竭死亡，而于GD 22.5時剖腹取出的仔鼠體重和發育正常，且可代乳存活；GD 21.5和GD 22.5時，對照組外周血孕酮水平快速下降至(6.7±4.4)nmol/L和(5.6±3.5) nmol/L，而實驗組孕酮水平分別為(19.7±7.0)nmol/L和(18.0±4.2)nmol/L，顯著高于對照組(P<0.05)；兩組孕鼠均分別在GD 19.5、GD 20.5以及GD 20.5、GD 21.5連續2 d給予米非司酮，均分別于GD 20.5和GD 21.5啟動分娩并正常生產。結論大鼠胚胎著床后給予來曲唑短暫抑制雌激素合成可導致孕鼠難產，妊娠末期給予米非司酮可以挽救難產結局。

【關鍵詞】大鼠；芳香化酶抑制劑；來曲唑；難產；孕酮 (

(JReprodMed2016，25(2)：148-153)

雌激素和孕激素作為重要的甾體類性激素，對于大鼠妊娠起始、妊娠中胎盤功能維持、胎兒生長發育以及分娩發動都有著重要作用。大鼠妊娠時，母體對血清孕酮較大范圍的波動是足以耐受的，孕酮水平升高5倍[1]或降低20%[2]對胚胎存活、胎盤及胎兒的發育幾乎沒有影響。研究顯示靈長類動物恒河猴中，在著床期給予抗雌激素抗體，其妊娠成功率僅為1/14，而正常對照組為3/4[3]；帽猴圍著床期給予他莫昔芬競爭性結合雌激素受體，可導致90%～100%的帽猴妊娠失敗，而對照周期妊娠成功率為66%[4]。臨床研究發現即使雌激素含量只有幾個毫微克的變化也足以導致體外受精(IVF)周期的失敗[5]。盡管雌激素對孕期及妊娠結局具有重要作用，但有關雌激素對妊娠影響的具體作用機理遠未闡明，僅70年代有過少量研究報告，近年來相關研究缺乏。

本研究組在有關探討雌激素對妊娠作用的前期研究中發現，在著床后即妊娠第6.5天(GD 6.5)至GD 8.5給予雌激素合成抑制劑來曲唑(0.16 mg/kg)，并不影響著床，但孕鼠在GD 22.5陰道少量出血，無法正常分娩，持續24 h之后，即GD 23.5時孕鼠因難產而體力衰竭死亡。孕早期雌激素水平的波動往往不容易被關注到，但其影響卻值得關注。因此，本研究對孕鼠難產的原因進行初步探討，以期幫助理解著床后雌激素波動在妊娠特別是分娩中的作用機制。

材料和方法

一、材料

1. 實驗動物：10～11周齡Wistar雌性大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，體重約250 g。飼養環境溫度20～22℃，相對濕度50%～60%，光周期調控：06∶00～18∶00光照，18∶00～06∶00黑暗，自由攝食進水。

2. 主要試劑及其配制：來曲唑片(弗隆，諾華制藥，瑞士)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，購自北京化學試劑有限公司)；米非司酮(原料藥，購自北京紫竹藥業)。將來曲唑溶于0.5%羧甲基纖維素鈉配置成0.04 mg/ml的混懸液；取1 g米非司酮溶于1 ml無水乙醇中，再加入9 ml無菌油混勻。

3. 實驗儀器：Leica LMD6000 激光顯微捕獲儀器(徠卡公司，德國)。

二、實驗方法

本研究經過實驗動物倫理委員會審核，符合動物保護、動物福利和倫理原則，符合實驗動物倫理的相關規定。

Wistar雌性大鼠與正常雄鼠交配，16：00將雌鼠和雄鼠按1∶1進行交配，次日9∶00檢查見陰道栓者為交配成功標志，記為GD 0.5。實驗組在GD 6.5、GD 7.5和GD 8.5連續3 d給予0.16 mg/kg/d來曲唑溶液灌胃；對照組同期給予相同劑量的溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液)灌胃。

1. 胎鼠生長狀況觀察：實驗組和對照組孕鼠在GD 15.5、GD 17.5、GD 19.5、GD 20.5、GD 21.5分別隨機處死5只孕鼠，取材并稱量胎鼠重量。實驗組在GD 22.5隨機選取5只，行剖腹產獲取仔鼠，并用正常孕鼠為剖腹產仔鼠代乳，觀察仔鼠生長情況至正常離乳。

2. 孕鼠孕期激素水平檢測：實驗組和對照組孕鼠從GD 9.5到GD 22.5，每天每組隨機選取5只孕鼠，行尾靜脈取血，每次取1.0 ml，室溫靜置40 min，3000 rpm離心5 min，取血清于-20℃冷凍保存。分別采用酶聯免疫試劑盒(南京建成生物)和放射免疫法(北京北方生物)測定血清中雌二醇和孕酮的含量。

3. 米非司酮挽救孕鼠難產實驗：實驗組和對照組孕鼠均分別在GD 19.5、GD 20.5以及GD 20.5、GD 21.5連續2日皮下注射10 mg/kg/d米非司酮溶液(每個處理組為7只)，觀察孕鼠分娩結局。

三、統計分析

結果

一、著床后短暫抑制體內雌激素合成對孕鼠分娩及胎鼠的影響

在所觀察的時間點(GD 15.5、GD 17.5、GD 19.5、GD 20.5、GD 21.5和GD 22.5)，實驗組和對照組孕鼠的窩仔數比較無顯著性差異(P>0.05)，相同胎齡的胎/仔鼠體重亦無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

對照組孕鼠(n=5)在GD 22.5全部順利分娩，仔鼠均為活胎且未見發育異常。實驗組孕鼠(n=5)在GD 22.5陰道少量出血，但不能正常分娩，至GD 23.5全部體力衰竭死亡，未有仔鼠產出。實驗組孕鼠(n=5)在GD 22.5行剖腹產后，其仔鼠均為活胎，仔鼠重量與同期自然分娩仔鼠重量比較無顯著性差異(P>0.05)，經自然分娩成功后的孕鼠代乳至正常離乳，觀察發現仔鼠初步表現正常，基本生命特征未見異常(表1)。

表1　著床后短暫抑制雌激素合成對大鼠胎兒體重的影響(x-±s)

注：a自主分娩產仔；b剖腹產

二、著床后短暫抑制體內雌激素合成對妊娠期激素水平的影響

對照組孕鼠尾靜脈血清雌二醇濃度在GD 9.5～16.5維持在一個相對穩定水平，(310.1±30.9)pmol/L～(411.7±20.5)pmol/L；實驗組在GD 6.5～8.5給予雌激素抑制劑來曲唑后，GD 9.5時的雌二醇濃度顯著低于對照組[(303.8±27.9)pmol/L vs.(394.1±31.6)pmol/L](P<0.01)(圖1A)，隨后逐漸接近對照組，推測為藥物清除半衰期內殘留的來曲唑效應，顯示該劑量濃度來曲唑能夠抑制大鼠著床后雌二醇合成。

對照組孕鼠尾靜脈血清孕酮濃度在GD 10.5出現上升[(52.8±6.0)nmol/L]，至GD 15.5達到高峰[(119.1±13.1)nmol/L]，隨后開始下降，GD 17.5時下降至(78.2±16.9)nmol/L，進而在鄰近分娩的GD 21.5和GD 22.5迅速下降至(6.7±4.4)nmol/L和(5.6±3.5)nmol/L。實驗組與對照組相比，在GD 9.5和GD 10.5時的孕酮水平明顯增高[(120.9±14.1)和(77.1±22.6)nmol/L vs.(88.1±18.5)和(52.8±6.0)nmol/L](P<0.05)，GD 15.5開始下降[(81.9±37.6)nmol/L]，至GD 17.5時下降至(29.1±8.1)nmol/L，隨后呈現緩慢下降，在GD 21.5和GD 22.5并未呈現快速下降[分別為(19.7±7.0)nmol/L和(18.0±4.2)nmol/L]，與對照組相比仍維持在一個較高水平(P<0.05)(圖1B)，至GD 22.5時，母鼠不能正常產仔。

注：兩組間比較，*P<0.05圖1　著床后(GD 6.5～8.5)給予來曲唑處理對妊娠期血清激素水平的影響

三、米非司酮挽救著床后短暫抑制雌激素合成誘發的難產現象

實驗組和對照組孕鼠均分別在GD 19.5、GD 20.5及GD 20.5、GD 21.5上午9∶00連續2 d給予米非司酮處理以拮抗孕酮受體的作用。結果顯示，在GD 19.5、GD 20.5給予米非司酮，實驗組(n=7)與對照組(n=7)表現一致，均在GD 20.5下午自主成功分娩，胎兒及胎盤全部娩出，實驗組未出現難產現象。在GD 20.5、GD 21.5給予米非司酮，實驗組(n=7)與對照組(n=7)表現也完全一致，全部孕鼠均在GD 21.5下午成功分娩且胎兒及胎盤全部娩出，實驗組未出現難產現象。對照組和實驗組窩仔數以及仔鼠重量比較未見統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2　妊娠末期給予米非司酮挽救著床后短暫抑制雌激素合成誘發的難產(x-±s)

注：全部孕鼠均自主分娩；a在GD 19.5、GD 20.5給予米非司酮組的分娩胎齡；b在GD 20.5、GD 21.5給予米非司酮組的分娩胎齡

討論

雌激素作為重要的甾體類性激素，是妊娠起始、妊娠維持、胎兒生長發育以及分娩發動相關的重要激素。藥理劑量外源性雌激素可導致孕期大鼠胚胎死亡、胎兒發育遲緩，甚至生理劑量的外源性雌激素都可以導致胎盤迷路發育異常[6]。對于圍孕期雌激素水平低下的研究，僅見早期研究報告，多采用抗雌激素抗體[3，7]和單側卵巢切除[8-9]降低雌激素水平，或使用選擇性雌激素受體調節劑降低雌激素作用[4]。來曲唑是非甾體高效選擇性的第三代芳香化酶抑制劑，與雌激素生物合成限速酶——芳香化酶中的亞鐵血紅素可逆性結合，可顯著降低雌激素水平[10]，是用來研究雌激素作用很好的藥物。本研究在前期工作中[11]，發現在大鼠妊娠GD 6.5～8.5即著床后給予0.04 mg/kg、0.16 mg/kg和0.4 mg/kg來曲唑抑制雌激素合成后，吸收胎比較無顯著性差異，胎/仔鼠發育正常。本研究中給予0.16 mg/kg劑量來曲唑，實驗組孕鼠雌激素水平顯著下降，提示為合適的研究用劑量。

本研究前期工作發現，大鼠著床后在GD 6.5～8.5給予來曲唑抑制雌激素合成后，實驗組孕鼠在GD 22.5未能正常分娩出仔鼠，出現難產現象，至GD 23.5體力衰竭而死；但在GD 22.5行剖腹產后發現仔鼠存活，與對照組出生仔鼠體重比較無顯著性差異；且實驗組仔鼠代乳喂養至正常離乳時，生命體征未見異常，提示胚胎因素不是難產的主要原因。

分娩啟動是一個復雜的調控過程。嚙齒類動物包括大鼠，妊娠末期外周循環中孕酮水平的快速下降是發動分娩的重要因素[12]；在人類和高等靈長類動物以及豚鼠中，孕期及分娩啟動時孕酮水平并不下降，而與子宮肌層中的孕酮受體水平有關[13-14]。我們發現在本研究孕期激素水平監測中，與對照組在GD 21.5和GD 22.5時孕酮水平的快速下降相比，實驗組孕酮在GD 21.5時仍維持在較高水平，二者比較具有顯著性差異，推測分娩前孕酮水平不能正常下降可能是實驗組出現難產的原因之一。

因此，我們分別在GD 19.5、GD 20.5以及GD 20.5、GD 21.5連續兩天給予米非司酮處理。米非司酮是孕酮受體拮抗劑，在受體水平阻斷孕酮的作用，導致孕酮功能性撤退[15]。在妊娠晚期，使用米非司酮可增加宮頸膠原分解，擴張和軟化宮頸，有利于宮頸成熟，也可增加前列腺素敏感性，促進宮縮，進而有利于啟動分娩和縮短產程[15-18]。本研究結果顯示，米非司酮拮抗孕酮受體使孕酮水平發生功能性撤退后，對照組和實驗組均在第2次服用米非司酮當天下午，即GD 20.5和GD 21.5下午啟動分娩并正常生產，胎兒及胎盤全部順利娩出，未出現難產現象。妊娠末期給予米非司酮后的實驗結果證實了假設，提示妊娠末期孕酮水平不能正常下降可能是大鼠著床后短暫抑制雌激素合成誘發的難產現象的主要原因之一。

此外，本研究發現實驗組孕酮水平在GD 13.5～19.5期間低于對照組。研究顯示妊娠時胎盤是合成雌孕激素的主要器官之一，并且雌激素可以調節孕酮的合成，妊娠中晚期給予抗雌激素Mer-25或芳香化酶抑制劑4-4-hydroxyandrostenedione，可導致孕酮水平降低，但在非孕大鼠(黃體是孕酮的主要來源)，則不影響孕酮水平[19-20]。然而，本研究中給予來曲唑處理的時間是著床后胎盤形成前(GD 6.5～8.5)，雖然并未影響著床，但很有可能已經影響蛻膜發育，進而導致胎盤形成出現異常(結果未顯示)，隨后胎盤中孕激素的合成與分解代謝受到影響，可能是孕酮水平在妊娠末期不能正常迅速下降的原因之一。妊娠期間甾體激素的代謝及其調節是非常復雜的，至今尚未完全解析。

綜上，在本研究中妊娠大鼠胚胎著床后使用芳香化酶抑制劑來曲唑短暫抑制體內雌激素合成，可以引起孕鼠妊娠末期出現難產，妊娠末期孕酮水平不能正常快速下降可能是導致難產的主要原因之一；而妊娠末期使用米非司酮能夠挽救大鼠著床后短暫抑制雌激素合成誘發的難產現象。本研究僅進行初步探討，其中涉及相應的具體機制尚有待于進一步深入研究。

【參考文獻】

[1]Bartholomeusz RK，Bruce NW. Effects of maternal progesterone supplementation of fetal，placental and corpus luteal weights in the rat [J]. Biol Reprod，1976，15：84-89.

[2]Elbaum DJ，Bender EM，Brown JM，et al. Serum progesterone in pregnant rats with ectopic or in situ corpora lutea：correlation between amount of luteal tissue and progesterone concentration [J]. Biol Reprod，1975，13：541-545.

[3]Ravindranath N，Moudgal RN. Effect of a specific estrogen antibody on pregnancy establishment in the bonnet monkey (Macaca radiata) [J]. Fertil Steril，1990，54：1162-1167.

[4]Ravindranath N，Moudgal NR. Use of tamoxifen，an antioestrogen，in establishing a need for oestrogen in early pregnancy in the bonnet monkey (Macaca radiata) [J]. J Reprod Fertil，1987，81：327-336.

[5]Sharara FI，Mcclamrock HD. Ratio of oestradiol concentration on the day of human chorionic gonadotrophin administration to mid-luteal oestradiol concentration is predictive of in-vitro fertilization outcome [J]. Hum Reprod，1999，14：2777-2782.

[6]Matsuura S，Itakura A，Ohno Y，et al. Effects of estradiol administration on feto-placental growth in rat [J]. Early Hum Dev，2004，77：47-56.

[7]Dray F，Csapo A，Erdos T，et al. Effects of antibodies to estradiol-17beta and to progesterone on the placental weight and pregnancy in rats--a quantitative study [J]. J Steroid Biochem，1975，6：547-548.

[8]Csapo AI，Wiest WG. Plasma steroid levels and ovariectomy-induced placental hypertrophy in rats [J]. Endocrinology，1973，93：1173-1177.

[9]Ross MH，Beaumont HM. Unilateral ovariectomy during pregnancy in mice [J]. J Reprod Fertil，1974，41：235-239.

[10]Baum M，Buzdar A，Cuzick J，et al. Anastrozole alone or in combination with tamoxifen versus tamoxifen alone for adjuvant treatment of postmenopausal women with early-stage breast cancer：results of the ATAC (Arimidex，Tamoxifen Alone or in Combination) trial efficacy and safety update analyses [J]. Cancer，2003，98：1802-1810.

[11]武斌. 雌激素對子宮內膜自發蛻膜化以及妊娠過程影響的初步研究[D]. 北京協和醫學院，2014：41-75.

[12]Virgo BB，Bellward GD. Serum progesterone levels in the pregnant and postpartum laboratory mouse [J]. Endocrinology，1974，95：1486-1490.

[13]Challis J，Matthews SG，Gibb W，et al. Endocrine and paracrine regulation of birth at term and preterm [J]. Endocr Rev，2000，21：514-550.

[14]Smith R，Smith JI，Shen X，et al. Patterns of plasma corticotropin-releasing hormone，progesterone，estradiol，and estriol change and the onset of human labor [J]. J Clin Endocrinol Metab，2009，94：2066-2074.

[15]Cadepond F，Ulmann A，Baulieu EE，et al. RU486 (mifepristone)：mechanisms of action and clinical uses [J]. Annu Rev Med，1997，48：129-156.

[16]Clark K，Ji H，Feltovich H，et al. Mifepristone-induced cervical ripening：structural，biomechanical，and molecular events [J]. Am J Obstet Gynecol，2006，194：1391-1398.

[17]Stenlund PM，Ekman G，Aedo AR，et al. Induction of labor with mifepristone--a randomized，double-blind study versus placebo [J]. Acta Obstet Gynecol Scand，1999，78：793-798.

[18]Dudley DJ，Branch DW，Edwin SS，et al. Induction of preterm birth in mice by RU486 [J]. Biol Reprod，1996，55：992-995.

[19]Albrecht ED，Pepe GJ. Placental steroid hormone biosynthesis in primate pregnancy [J]. Endocr Rev，1990，11：124-150.

[20]Albrecht ED，Pepe GJ. Effect of the antiestrogen ethamoxytriphetol (MER-25) and luteectomy on serum progesterone concentrations in pregnant baboons [J]. Endocrinology，1984，115：1717-1721.

[編輯：羅宏志]

數字對象唯一標識(digital object identifier,DOI)被形象地稱為“英特網上的條形碼”，如同貼了標簽的商品，數字對象一旦被分配一個DOI號，無論它處于英特網上的任何位置，通過DOI都能夠找到它，因此解決了傳統網絡標識系統的不穩定性，實現了更有效的網絡鏈接。DOI技術將成為國際上數字出版界構建數字信息交換平臺的首要選擇。

美國出版協會(AAP)于1998年創建了DOI以來，制定了標準，并建立了相應的解析系統，目前在出版界得到了廣泛和成功的應用。DOI已用于期刊、電子書、技術報告、標準等各種文獻類型的標識，并向與文獻相關的科學數據、版權、甚至作者標識等多元化方向發展。截止2008年4月底，DOI的注冊量已超過了3 000多萬個，應用DOI的出版社和學會有2 500多家，圖書館1 300多個。萬方數據公司已獲得了在中國注冊DOI代理機構權。

中國科學技術信息研究所精品科技期刊項目組已經向DOI中文注冊機械申請精品科技期刊前綴，并對300種精品科技期刊每一篇論文注冊DOI號，并可通過DOI中文注冊機構的DOI解析服務器(http://www.chinadoi.cn/)提供精品科技期刊數字資源的查詢和解析。另外，還可通過(http://dx.doi.org/DOI)查詢資料。

本刊已在萬方數據公司注冊了DOI號，自2009年起本刊采用DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2009.--.---。之后，凡在本刊刊登的論文將獲得更寬廣的數字信息交流平臺。

(本刊編輯部)

本刊論著英文摘要書寫方法

我刊自2001年第1期開始論著中英文摘要的書寫方法，采用結構式，明確標出摘要內容，必需有標題。參照幾本國際著名雜志如Fertil Steril等摘要包括下列標題：

目的(Objective)：論文研究的主要目的，用一句話概括。

方法(Methods)：臨床研究中受試對象的基本情況和條件；所采用的技術方法(實驗室技術扼要描述，若是常規方法只需提方法名稱，無需描述)；結果的主要指標。

結果(Results)：研究結果的總結，將論文結果的主要數據列出，此段是最主要的部分。

結論(Conclusions)：每項研究必須有結論，反映作者從研究中得出的結論性意見及作者的觀點。

作者可根據論著內容的酌情選擇標題，但至少必須有5項：目的、方法、結果、結論及關鍵詞。具體請參考本刊論著中英文摘要。自即日起投稿者必須附結構式中英文摘要，以免影響稿件受理。

本刊編輯部

Effect of transient inhibition of estrogen production after implantation on pregnancy outcome in rat

YUANFeng1，2，WUBin3，HEBin2*，XUXiang-bo2，BAOGuo2，ZHANGShu-cheng2，WANGJie-dong2*

1.GraduatedSchool，PeckingUnionMedicalCollege，Beijing100730

2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing100081

3.JinanCentralHospital，Jinan250013

【Abstract】

Objective： To determine the effect of transient inhibition of estrogen production in post-implantation period on pregnancy outcome in normal rats.

Methods： Letrozon，an aromatase inhibitor，was intragastrically administered to pregnant rats at a dose of 0.16 mg/kg/day from gestation day (GD) 6.5 to 8.5 (treated group)，or vehicle as a control (control group). Fetal development and pregnancy outcomes were examined.

Results： There was no significant difference in litter size and fetal weight between letrozole treated group and control group (P>0.05). The pregnant rat in control group normally completed parturition at GD 22.5，but the rats in letrozole treated group cannot deliver normally at GD 22.5，and ended in death with physical exhaustion at GD 23.5. When cesarean was performed at GD 22.5 in treated rats，it was found that offspring weight and development were normal，and the pups can be survived from milk replacer. The serum progesterone levels of maternal rats in control group rapidly declined to (6.7±4.4)nmol/L and (5.6±3.5)nmol/L at GD 21.5 and GD 22.5 respectively，but the progesterone levels in treated group was (19.7±7.0)nmol/L and(18.0±4.2) nmol/L respectively. There was a significant difference between the treated and control group (P<0.05). When mifepristone of 10 mg/kg/day was subcutaneously injected for two days at GD 19.5 & GD 20.5 and GD 20.5 & GD 21.5 respectively，all maternal rats in the treated and control group completed parturition at GD 20.5 and GD 21.5 respectively.

Conclusions： These results demonstrated that transient inhibition of estrogen synthesis in post-implantation period in maternal rats can result in dystocia at term. And administered mifepristone at term can rescue the dystocia.

Key words：Rat；Aromatase inhibitors；Letrozole；Dystocia；Progesterone )：主題詞不多于5個。

【作者簡介】苑鳳，女，吉林汪清人，碩士，細胞生物學專業.(*通訊作者)

【基金項目】中央級公益性科研院所基本科研專項(2012GJSSJKA01)；十二五國家科技支撐計劃項目課題(2012BAI31B06)

【收稿日期】2015-08-05；【修回日期】2015-10-15

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.009 搭建信息資源的橋梁