卵泡刺激素和干細胞因子對大鼠非梗阻性無精子癥模型生精功能的影響

曹宇，劉仲偉，孟昱時，程波，邱學德，李志鵬，曹貴華，何進，和術臣

(1. 昆明醫科大學第二附屬醫院生殖醫學科，昆明　650101；2. 湖南中醫藥大學附屬寧鄉醫院泌尿外科，長沙　410600；3. 滕州市中心人民醫院泌尿外科，滕州　277500；4. 昆明醫科大學第二附屬醫院男性科，昆明　650101；5. 昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，昆明　650101)

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卵泡刺激素和干細胞因子對大鼠非梗阻性無精子癥模型生精功能的影響

曹宇1，2，劉仲偉1，孟昱時1，程波3，邱學德4*，李志鵬5，曹貴華5，何進5，和術臣5

(1. 昆明醫科大學第二附屬醫院生殖醫學科，昆明650101；2. 湖南中醫藥大學附屬寧鄉醫院泌尿外科，長沙410600；3. 滕州市中心人民醫院泌尿外科，滕州277500；4. 昆明醫科大學第二附屬醫院男性科，昆明650101；5. 昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，昆明650101)

【摘要】目的探討卵泡刺激素(FSH)、干細胞因子(SCF)對Wistar大鼠非梗阻性無精子癥(NOA)動物模型生精功能的影響。方法使用白消安15 mg/kg單次腹腔注射制作Wistar大鼠NOA動物模型，抽樣檢查模型制造成功后。隨機抽取72只大鼠分為兩組：治療組給予大鼠后腿肌肉注射FSH 250 mU/次和SCF 150 ng/次，每3 d重復注射1次，共注射19次；對照組予以等量的生理鹽水行大鼠后腿肌肉注射。治療組和對照組均于用藥后19 d、38 d和57 d摘取一側睪丸制成石蠟病理切片，采用Johnsen法評價其生精功能；取一側附睪計數附睪尾精子數，每組每次12只。結果治療組用藥19 d、38 d和57 d睪丸組織切片Johnsen評分均顯著高于對照組(P均<0.05)；用藥后19 d 和38 d治療組睪丸內曲細精管排列較對照組緊密、整齊；管腔內各級生精細胞數量亦多于對照組；用藥后57 d治療組睪丸內曲細精管與正常睪丸基本一致，而同期對照組內有不少曲細精管局部呈現“空泡樣”結構。用藥后19 d，兩組附睪內均未見精子；用藥38 d時治療組附睪內精子數[(77.55±55.18)個/ml]顯著高于對照組[(41.05±29.20)個/ml](P<0.05)；用藥57 d時治療組附睪內精子數[(122.13±80.67)個/ml]亦顯著高于對照組[(58.50±26.15)個/ml](P<0.05)。結論FSH聯合SCF肌注能夠促進Wistar大鼠NOA模型生精功能的恢復。

【關鍵詞】非梗阻性無精子癥模型；卵泡刺激素；干細胞因子；生精功能

Effect of FSH and SCF on spermatogenesis of non-obstructive azoospermia in rat models

CAOYu1，2，LIUZhong-wei1，MENGYu-shi1，CHENGBo3，QIUXue-de4*，LIZhi-peng5，CAOGui-hua5，HEJin5，HEShu-chen5

1.DepartmentofReproductiveMedicine，the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101

(JReprodMed2016，25(2)：160-165)

非梗阻性無精子癥(NOA)因為精液中缺乏精子，臨床上一度缺少有效的治療方法，隨著人類輔助生殖技術的誕生和快速發展，使得NOA患者的治療出現了突破性的進展。然而對于那些睪丸內無精子生成的NOA患者，目前臨床上仍然缺乏有效的治療手段。有研究報道FSH可以通過改善精子的超微結構和精子線粒體DNA的聚合，提高精子質量與濃度[1]，干細胞因子(SCF)可促進A型精原細胞DNA的合成[2]，在原始生殖細胞和精原細胞的粘附、遷移、增殖和存活中也發揮著重要作用[3]。本研究利用白消安單次腹腔注射建立Wistar大鼠NOA動物模型，并通過將FSH和SCF聯合注射于NOA模型，探討FSH和SCF對大鼠NOA模型生精功能的影響，現將結果報告如下。

材料與方法

一、研究對象

1. 實驗動物：選用SPF級成年雄性Wistar大鼠150只，體重220～280 g[實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2009-0012，實驗動物質量合格證號：HNACSDC20100520]。

2. 主要試劑及圖像分析系統：Bouin's液，由昆明醫科大學病理科提供，使用前配制；FSH、SCF、白消安(Sigma，美國)；伊紅(The Coleman & Bell，美國)；蘇木素(上?；瘜W試劑)；顯微攝影系統DM4000B、數碼相機DFC320、攝影軟件IM50(Leica，德國)；HPIA-2000高清晰度病理圖文分析系統(同濟大學)；病理切片的制作及觀察均由昆明醫科大學病理科錢忠義老師幫助完成。

二、研究方法

1. 大鼠NOA模型的制作和檢測：采血檢測成年雄性大鼠血清性激素水平，排除有內分泌疾病者(該部分實驗由昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科陳江醫生協助完成)。對成年雄性大鼠予以白消安15 mg/kg單次腹腔注射[4]，38 d后從存活的大鼠中，隨機抽取10只大鼠取一側睪丸和附睪作組織切片，以睪丸切片見不到精子細胞和精子，附睪切片內見不到精子為標準，并與正常大鼠的睪丸和附睪切片比較，檢驗大鼠NOA模型是否成功。

2. 動物模型分組和用藥方式：取72只NOA模型大鼠隨機分為兩組。治療組36只，于大鼠后腿肌肉注射 FSH 250 mU/次和SCF 150 ng/次，每3 d重復注射1次，共注射19次；對照組36只，給予同等體積的生理鹽水行大鼠后腿肌肉注射，次數與實驗組相同。

3. 標本采集：治療組和對照組均于用藥后19 d、38 d和57 d摘取一側睪丸制備石蠟切片；取一側附睪行計數附睪尾精子數，完整剪下附睪尾，置于1 ml生理鹽水中剪碎組織，37℃水浴10 min后，用吸管吹出精子使之游離，離心后計數精子數；每組每次12只。

4. 標本觀測指標：切片制成后，每份標本觀察25個垂直切面，Johnsen評分評價睪丸組織生精功能，其評價標準[5]為：完好的精子發生為10分；各級生精細胞存在但排列紊亂者為9 分；僅有少量精子(>10個)者為 8分；無精子但有大量精子細胞者為7 分；無精子僅有少量精子細胞(5～10個)者為6分；無精子但有較多精母細胞者為 5 分；無精子細胞僅有個別精母細胞(<5個)者為 4 分；僅有精原細胞為 3 分；無生精細胞僅有支持細胞為2 分；管腔內無細胞為1 分。另外，對附睪管內精子數進行計數。

三、統計學分析

結果

一、大鼠NOA模型建立

注射白消安38 d后，隨機抽取10只建模大鼠，取一側睪丸和附睪作組織切片，組織形態學顯示：建模大鼠睪丸萎陷，睪丸血供較差；附睪形態基本正常，顏色較晦暗。光鏡下可見：睪丸生精小管萎縮，支持細胞數量減少，各級生精細胞基本消失，排列紊亂；生精小管腔隙擴大，出現“空泡樣”改變。附睪管僅存附睪管上皮細胞，管腔內見不到精子(圖1A、B)。認為大鼠NOA模型建立成功。

A：睪丸　　　　　　　　　　　　　　　B：附睪圖1　建模大鼠睪丸、附睪切片 HE染色，×400

二、正常大鼠睪丸、附睪的組織形態觀察

正常大鼠的睪丸切片內可見形態正常的曲細精管，排列緊密，界線清晰;管腔內各級生精細胞排列規整，可見大量形態正常的精子;支持細胞數量正常、形態飽滿。附睪管腔排列緊密，形態規整，上皮細胞呈單層有序排列，管腔內可見大量的精子，且形態良好(圖2A、B)。

A：睪丸　 　　　　　　　　　　　　B：附睪圖2　正常大鼠睪丸、附睪切片 HE染色，×400

三、不同用藥時間兩組大鼠睪丸組織形態觀察

用藥19 d后，與對照組比較，可見治療組睪丸切片內曲細精管排列緊密，曲細精管間的血管較對照組多，血管管腔也較對照組大。曲細精管管腔內，各級生精細胞數量較對照組多，排列整齊，且細胞形態和飽滿程度與正常生精細胞基本一致。治療組內的“空泡樣”結構亦較對照組少(圖3 A、B)。

A：用藥19 d治療組；B：用藥19 d對照組；　　　　C：用藥38 d治療組；D：用藥38 d對照組；　　　　E：用藥57 d治療組；F：用藥57 d對照組圖3　不同用藥時間大鼠睪丸組織形態觀察 HE染色，×400

用藥38 d后，可見治療組睪丸切片內曲細精管排列較對照組規則、整齊，管腔內可見各級生精細胞排列規整，且各級細胞數量亦較對照組多；曲細精管間的血管較對照組多；支持細胞形態較飽滿。對照組內可見少量“空泡樣”組織結構(NOA模型成功后的結構)，而治療組幾乎沒有(圖3 C、D)。

用藥57 d后，治療組睪丸切片內曲細精管排列規則、整齊，基本與正常睪丸組織一致；且可見較多血管，血管管腔大，提示局部血供較好。對照組內則可見部分曲細精管及各級生精細胞恢復，顯示出較明顯的各級生精細胞的層次結構，但仍有不少曲細精管局部呈現出“空泡樣”結構，甚至整個曲細精管內找不到生精細胞；血管形態相對不明顯(圖3E、F)。

六、不同用藥時間兩組睪丸Johnsen評分及附睪精子計數比較

用藥后不同時間，治療組睪丸Johnsen評分均顯著高于對照組(P均<0.05)；用藥后第19天，兩組附睪內均未見精子，用藥后第38、57天，治療組附睪內精子數顯著高于對照組(P均<0.05)(表1)。

表1　不同時間兩組睪丸Johnsen評分及

注：與對照組同一時間比較，*P<0.05

討論

自ICSI用于臨床以來，幫助很多NOA患者獲得了生育。理論上只要獲得少量精子，NOA患者就可以通過ICSI獲得生育機會。然而，即使采用睪丸取精成功率最高的顯微切割睪丸精子抽吸術，仍有近一半的NOA患者睪丸內無法找到精子[7]。但也有學者研究發現NOA睪丸取精失敗者即使睪丸內無精子，也多能在睪丸組織的局部發現殘存的各級生殖細胞[7-8]。

有研究報道，行生殖細胞體外成熟培養時，在培養基中加入高濃度的FSH和睪酮(T)，可提高精子分化生成的速度，表明增加激素濃度有利于激素與其受體有效結合，促進精子生成與分化，且能有效抑制生精細胞的凋亡[9]。體外培養的研究結果提示NOA患者睪丸組織中殘存的生殖細胞是可以增殖分化的。

在激素對精子發生的調控過程中，支持細胞處于核心地位，其中FSH與生殖過程密切相關，FSH是雄性精子發育以及支持細胞生長的基礎[10]。FSH與支持細胞膜上的卵泡刺激素受體(FSHR)結合，激活環腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、鈣離子通道等信號通路，將來自FSH的信號轉化為生精細胞所需要的各種因子信號，促進生精過程[11-12]。有研究證實，FSH不僅可以促進早期生精細胞發育和精原細胞的分裂，還可以作用于間質細胞，分泌雄激素結合蛋白，促進精子生成；并通過改善精子超微結構和精子線粒體DNA的聚合提高精子的濃度和活動力[1，13]。Dorrington等[14]通過研究發現，在大鼠嬰幼兒時期，注射FSH可以促進睪丸支持細胞的有絲分裂。在動物研究中發現，注射FSH可以誘導未成熟小鼠精子發生，并促進性早熟[15]。Jafarian等[16]通過將FSH和戊酸雌二醇注射于白消安制成的小鼠無精子癥模型，發現單獨注射FSH可促進生精功能的恢復。

支持細胞還可以產生SCF，SCF是c-kit酪氨酸激酶受體的配體，是原始生殖細胞體外培養存活所必須，在睪丸發育過程中，其與原始生殖細胞、精原細胞的粘附、遷移、增殖和存活密切相關，并刺激原始生殖細胞和A型精原細胞的DNA合成[17]。在成人睪丸中，支持細胞受到FSH刺激以后，c-kit受體可在除生殖干細胞以外的各級精原細胞中表達；在體外培養中FSH可防止生殖細胞凋亡，隨著FSH刺激的增加，SCF水平相應升高[3]。表明FSH可能通過SCF-c-kit通路發揮對生殖細胞的保護作用。在睪丸功能失調患者的體內存在SCF/c-kit基因表達的缺陷，在生精障礙和無精子癥患者體內生精細胞凋亡過程的增加也和SCF/c-kit表達的減少存在聯系[18]。Yan等[3]將曲細精管在有或無SCF刺激的條件下進行體外培養，通過DNA梯狀條帶和原位末端標記染色測定細胞凋亡，發現SCF處理組較對照組細胞凋亡發生時間較晚，凋亡程度也較低；當SCF缺乏時，FSH對生殖細胞的保護作用隨之下降。在使用白消安制成的大鼠NOA模型中，睪丸組織內SCF/c-kit的調節通路發生改變，使轉錄因子E2F處于無活性狀態，不能正常啟動增殖細胞核抗原基因的轉錄，并使G1期特定蛋白表達受到抑制，誘導生殖細胞的凋亡[19]。Plotton等[20]在一項研究中使用免疫組織化學的方法，比較49例正常生精、生精功能低下、生精阻滯、唯支持細胞綜合征患者睪丸組織中SCF的表達情況，發現生精功能低下、生精阻滯和唯支持細胞綜合征患者睪丸組織中SCF的表達較正常對照組降低。

綜上所述，本研究結果顯示FSH、SCF對NOA大鼠模型有較明顯的治療效果，能明顯改善生精功能，提示對于NOA患者，也許可以通過補充外源性的FSH和SCF，提高體內FSH和SCF濃度，促進生殖細胞分裂分化為精子，以期改善NOA患者助孕治療的結局。但本研究為動物實驗，旨在提供一個研究思路，后期尚需要進一步的研究和探討。

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[編輯：郭永]

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本刊編輯部

2.DepartmentofUrology，NingxiangHospitalAffiliatedtoHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410600

3.DepartmentofUrology，theCentralHospitalofTengzhou，Tengzhou277500

4.DepartmentofAndriatrics，the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101

5.DepartmentofUrology，the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming

650101

【Abstract】

Objective： To assessment the influence of FSH and stem cell factor (SCF) on the spermatogenic function in rat models of non-obstructive azoospermia.

Methods： The 72 rat models of non-obstructive azoospermia were prepared by injecting busulfan at a dose of 15 mg/kg into the abdominal cavity for each rat. The rat models were divided into two groups after successful establishment. The rats in treatment group were injected with 250 mU FSH and 150 ng SCF into hind leg muscle，every three days for 19 times. The rats in the control group were given equal amount of normal saline in the same way. The unilateral testis and epididymis of the rats were respectively obtained for morphological examination or sperm count on the 19th，38thand 57thday after administration. The spermatogenesis was evaluated by Johnsen score，and the sperm number in unilateral epididymis was accounted by CASA，twelve rats for each time.

Results： The Johnsen scores of the rats in the treatment group were significantly higher than those in the control group on the 19th，38thand 57thday after administration (P<0.05). The arrangements of seminiferous tubule of the treatment groups were more tightness than the control groups，and the number of spermatogenic cells at all stage in the lumen in the treatment groups were more than the control groups on the 19thor 38thday after administration. The morphology of seminiferous tubules in the treatment group was similar as normal testis，while that in the control groups showed "vacuole-like" structure on the 57thday after administration. There was no sperm in the epididymis tube in both of treatment and control group on the 19thday after administration. The sperm counts in the epididymis tube in treatment group on the 38thday after administration [(77.55±55.18)/ml] were significantly higher than those in the control group [(41.05±29.20)/ml] (P<0.05)，and it was similar on the 57thday after administrating [(122.13±80.67)/ml vs. (58.50±26.15)/ml) (P<0.05).

Conclusions： FSH and SCF by injecting muscle can improve the spermatogenesis recovery of Wistar rat with non-obstructive azoospermia.

Key words：Non-obstructive azoospermia model；FSH；Stem cell factor；Spermatogenesis

【作者簡介】曹宇，男，湖南長沙人，碩士研究生，主治醫師，泌尿外科和男性不育專業.(*通訊作者，Email：scottqiucn@126.com)

【基金項目】國家自然基金項目(30760250)

【收稿日期】2015-04-10；【修回日期】2015-06-20

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.011