慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細(xì)胞研究

傅繼凡　陳　健

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建　廈門　361000)

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慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細(xì)胞研究

傅繼凡陳健1

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門361000)

〔摘要〕目的探討慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細(xì)胞的可行性。方法誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)培養(yǎng)成破骨樣細(xì)胞(OLC)后，將其用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的對(duì)照慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察不同感染復(fù)數(shù)(MOI)時(shí)慢病毒轉(zhuǎn)染OLC的熒光率，并用TRAP染色鑒定OLC。選擇最適宜的MOI并加入不同干預(yù)進(jìn)行對(duì)照，分為OLC對(duì)照組、NFAT2抑制劑(VIVIT)組、NFAT2iRNA慢病毒組、對(duì)照病毒組，用RT-PCR進(jìn)行基因驗(yàn)證。結(jié)果對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染后，OLC隨著MOI值的升高，熒光轉(zhuǎn)染率增加；MOI=15時(shí)熒光數(shù)最多(41.00±9.19)個(gè)/視野。不同干預(yù)后，NFAT2抑制劑組和NFAT2iRNA慢病毒組的NFAT2的基因表達(dá)明顯低于OLC對(duì)照組和對(duì)照病毒組(P<0.05)。結(jié)論慢病毒可轉(zhuǎn)染大鼠破骨樣細(xì)胞，并在一定范圍內(nèi)隨MOI升高轉(zhuǎn)染率增高。

〔關(guān)鍵詞〕慢病毒；破骨樣細(xì)胞；活化T細(xì)胞核因子家族

1廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科

第一作者：傅繼凡(1990-)，女，在讀碩士，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

骨代謝的平衡由骨形成和骨吸收維持,成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞(OC)起著重要作用。其中，OC是一種具有獨(dú)特骨吸收功能的多核巨細(xì)胞，來源于造血細(xì)胞系，屬于終末細(xì)胞，不能增殖和傳代〔1〕。而破骨樣細(xì)胞(OLC)是指具有OC性質(zhì)，通過原代培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)誘導(dǎo)生成的，用于實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞。到目前為止，還沒有成熟的OC株。自從Testa等〔2〕首次在體外培養(yǎng)骨髓造血細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)能夠形成OC后，骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)法分化OLC的技術(shù)形成并逐漸開展應(yīng)用。獲得OC的方法多種多樣，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)、直接培養(yǎng)等技術(shù)都逐漸趨于穩(wěn)定成熟，有助于著手從基因水平深入研究骨吸收的機(jī)制，從而進(jìn)一步開發(fā)代謝性骨病的治療藥物。本文擬證實(shí)慢病毒轉(zhuǎn)染OLC的可行性，為進(jìn)一步利用OLC進(jìn)行基因?qū)W研究奠定重要基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡雌性SD大鼠，購自吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑、材料和儀器低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，中美胎牛血清(Bioind)，紅細(xì)胞裂解液，雙抗、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Gibco公司)，鼠M-CSF、RANKL(美國Peprotech公司)，抗酯酸性蛋白酶染色試劑盒(TRAP，美國Sigma公司)，NFAT抑制劑(德國Calbiochem公司)，Trizol(美國Ambion公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，SYBR Green試劑(Invitrogen)，NFAT2RNAi慢病毒、對(duì)照病毒由廈門欣基公司包裝合成，引物由上海生工公司合成；10 cm培養(yǎng)皿、六孔板(美國Corning公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，DM2500熒光顯微鏡(德國Leica公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀7500型(美國ABI公司)。

1.3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離與誘導(dǎo)培養(yǎng)取SD大鼠麻醉后處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨和脛骨，剔除多余軟組織，用5 ml注射器吸取適量低糖DMEM沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白，取沖洗液充分吹打制成細(xì)胞懸液后離心，800 r/min，3 min。棄上清加紅細(xì)胞裂解液，混勻靜置2 min，800 r/min離心3 min，棄上清去除紅細(xì)胞，得到白細(xì)胞沉淀。重懸于含25.0 ng/ml M-CSF +50.0 ng/ml RANKL的低糖DMEM完全培養(yǎng)液(含10%FBS、1%青霉素與鏈霉素)，接種于10 cm培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105重懸于含25.0 ng/ml M-CSF +50.0 ng/ml RANKL(大鼠)的低糖DMEM完全培養(yǎng)液，接種于六孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)，首次半定量換液，以后每隔3 d換液。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染OLC并分組以hela細(xì)胞(2.5×104/孔)對(duì)比，待獲得的OLC生長融合達(dá)約60%時(shí)，對(duì)照病毒(無NFAT2沉默)轉(zhuǎn)染按感染復(fù)數(shù)(MOI)15、5、1各分為三組，18 h后首次換液，此后每2~3 d換液1次并于第5天觀察熒光表達(dá)情況，熒光顯微鏡(×200)下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝OLC和hela細(xì)胞，并用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件計(jì)數(shù)。

1.5TRAP染色及計(jì)數(shù)將OLC于轉(zhuǎn)染后第5天棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，檸檬酸鹽/丙酮固定液室溫下固定30 s，用蒸餾水沖洗、晾干，按試劑盒說明書行TRAP染色，倒置相差顯微鏡(×200)下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)3個(gè)核以上破骨細(xì)胞，并在200倍光鏡下，用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件計(jì)數(shù)。

1.6NFAT2抑制劑干預(yù)OLC將獲得的OLC融合率達(dá)到60%左右時(shí)，進(jìn)行不同干預(yù)并分為OLC對(duì)照組、NFAT2抑制劑(VIVIT)組、NFAT2iRNA慢病毒組、對(duì)照病毒組。NFAT2iRNA慢病毒組和對(duì)照病毒組病毒劑量均以MOI=15為參數(shù)，VIVIT試劑以2 μmol/L每孔連續(xù)干預(yù)3 d，此后每2~3 d換液1次并于第5天進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.7RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞總RNA用Trizol提取。取總RNA 2 μg,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)步驟完成反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH為內(nèi)參照,取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別以下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列及反應(yīng)條件：①NFAT2：順向GGAGGGAAGAAGATGGTGTTGT,反向CTGGTTATTCTCTGGTTGCGG；②GAPDH：順向AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,反向CGTTGAACTTGCCGTGGGTAG；反應(yīng)條件:95℃ 30 s后,95℃ 5 s,60℃ 34 s，反復(fù)循環(huán)40次,95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s后結(jié)束反應(yīng)。采用2-ΔCt的方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，公式：目的基因表達(dá)量=2-ΔCt,ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件選用單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD方法統(tǒng)計(jì)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞生長特性倒置顯微鏡下觀察，大鼠BMSCs培養(yǎng)24 h后開始貼壁，呈梭形，誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸變大，集落融合成多核破骨細(xì)胞，第9天時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最佳，數(shù)量最多，隨后細(xì)胞開始皺縮，出現(xiàn)大量空泡。MOI=15、5、1均未見明顯的細(xì)胞毒性。見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染及計(jì)數(shù)帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染OLC后第5天在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染上的OLC發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，胞體大、形態(tài)不一、核數(shù)≥3、細(xì)胞外圍有一明顯皺褶緣。隨著MOI值的升高，hela的轉(zhuǎn)染數(shù)增加，各組之間比較均有顯著差異(P<0.01)。OLC組在MOI=15時(shí)，轉(zhuǎn)染數(shù)最多，與MOI=5、1比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。MOI=15時(shí)，OLC褶皺緣明顯、熒光強(qiáng)；MOI=5、1時(shí)，轉(zhuǎn)染的OLC熒光較弱，皺褶緣少，其他細(xì)胞轉(zhuǎn)染較多。見圖2，表1。

圖1　不同時(shí)間點(diǎn)OLC的形態(tài)(×200)

圖2　熒光顯微鏡OLC及hela細(xì)胞(×200)

組別MOI=15MOI=5MOI=1hela308.40±26.091)2)187.80±23.891)52.00±12.25OLC41.00±9.194.60±1.143)1.80±1.103)

與MOI=1比較:1)P<0.01;與MOI=5比較:2)P<0.01；與MOI:15比較：3)P<0.01

2.3TRAP染色及數(shù)量誘導(dǎo)的OLC經(jīng)TRAP染色后胞質(zhì)深染呈紫紅色，而胞核陰性，核數(shù)目≥3，多位于周邊。經(jīng)Image-Pro Plus計(jì)數(shù)分析后，MOI=15組(53.60±3.65)、MOI=5組(47.20±3.83)、MOI=1組(48.80±7.12)細(xì)胞數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)。見圖3。

圖3　誘導(dǎo)法OLC的TRAP鑒定

2.4NFAT2iRNA慢病毒轉(zhuǎn)染OLC后NFAT2的表達(dá)不同病毒轉(zhuǎn)染OLC后熒光顯微鏡下觀察，與對(duì)照病毒組比較，NFAT2iRNA慢病毒組OLC數(shù)目少，熒光強(qiáng)度弱，未見皺褶緣。經(jīng)過不同干預(yù)后，NFAT2抑制劑組(0.009 7±0.001 7)和NFAT2iRNA慢病毒組(0.009 6±0.002 0)的NFAT2基因表達(dá)明顯低于OLC對(duì)照組(0.015 8±0.002 6)和對(duì)照病毒組(0.015 9±0.002 5)(P<0.05)。而OLC對(duì)照組和對(duì)照病毒組、NFAT2抑制劑組和NFAT2iRNA慢病毒組之間的NFAT2基因表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見圖4。

圖4　慢病毒轉(zhuǎn)染后第5天熒光顯微鏡下破骨樣細(xì)胞(×200)

3討論

骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松、Paget病、牙周炎等病理變化都存在骨吸收異常，其中OC起重要作用〔3〕。OC在體外很脆弱，培養(yǎng)難度高，純度不高。本實(shí)驗(yàn)將大鼠BMSC在體外培養(yǎng)過程中加25.0 ng/ml M-CSF +50.0 ng/ml RANKL 進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得一定量的成熟OLC，觀察培養(yǎng)至第9天時(shí)數(shù)量最多，與其他培養(yǎng)方法比較，與體內(nèi)OC生物學(xué)功能最接近〔4〕，最適合用于體外深入研究。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久穩(wěn)定的表達(dá)。在感染能力方面不同于腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，可有效地感染一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化細(xì)胞等，適用于OC的體外研究〔5〕。GFP是一種新型報(bào)告基因，與目的基因構(gòu)成融合基因后，通過載體(如質(zhì)粒、慢病毒、腺病毒)轉(zhuǎn)染，細(xì)胞可表達(dá)GFP蛋白，產(chǎn)生綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染效果與MOI值有密切關(guān)系，隨MOI值的增加而升高，TRAP染色進(jìn)一步驗(yàn)證MOI=15、5、1對(duì)細(xì)胞均無較明顯毒性作用。

Ca2+/NFATc1信號(hào)通路是OC內(nèi)重要的信號(hào)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)OC的分化和成熟〔6〕。活化T細(xì)胞核因子家族中的NFATc1已被證實(shí)是其中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與許多OC特異性基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)OC分化和骨吸收功能至關(guān)重要〔7〕。有研究表明，NFATc1基因敲除的小鼠表現(xiàn)為骨硬化癥〔8〕；其基因缺陷的胚胎干細(xì)胞不能分化成OC，但表達(dá)外源性NFATc1的前體細(xì)胞在沒有RANKL的情況下也能向OC分化〔9〕。因此，可選擇最適宜的MOI值用NFAT2iRNA慢病毒對(duì)OC進(jìn)行基因驗(yàn)證。NFAT2iRNA慢病毒進(jìn)入OC轉(zhuǎn)染成功后使NFAT2基因沉默，表達(dá)下降，而對(duì)照病毒沒有使NFAT2沉默的作用，同時(shí)加入VIVIT作為對(duì)照，VIVIT組和NFAT2iRNA慢病毒組的NFAT2基因表達(dá)明顯低于OLC對(duì)照和對(duì)照病毒組，說明轉(zhuǎn)染成功。此外，熒光顯微鏡也進(jìn)一步證明NFAT2對(duì)OC的分化和成熟的重要性。

體外成功轉(zhuǎn)染OC的主要措施：保證轉(zhuǎn)染前細(xì)胞活性處于最佳狀態(tài)；病毒轉(zhuǎn)染前更換新培養(yǎng)基效果最好；加病毒后一般需在8~12 h更換培養(yǎng)基。經(jīng)過反復(fù)大量實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于OC 18個(gè)小時(shí)為最佳換液時(shí)間；采用1~2個(gè)月大鼠，所誘導(dǎo)的OC最多；動(dòng)物從處死到分離細(xì)胞速度要快，OC不易受損；嚴(yán)格無菌操作，誘導(dǎo)因子足量；采用差速貼壁法純化OC，因所分離成纖維細(xì)胞等貼壁速度快，在培養(yǎng)24 h后收集未貼壁細(xì)胞接種至另一培養(yǎng)板中可提高純度；純化后OC為更好貼壁，2~3 d內(nèi)需要靜置培養(yǎng)，不宜挪動(dòng)。

綜上所述，此次OC轉(zhuǎn)染成功為今后骨代謝疾病的基因治療開拓了廣闊的道路，利用攜帶目的基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染OLC，研究骨吸收的具體分子機(jī)制及有關(guān)OC內(nèi)分化的信號(hào)通路是今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的方向。

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〔2015-05-11修回〕

(編輯袁左鳴)

Research of lentivirus transfect osteoclast-like cells

FU Ji-Fan,CHEN Jian.

College of Medicine,Xiamen University,Xiamen 361000,Fujian,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the feasibility of lentivirus transfect osteoclast-like cells.MethodsAfter the bone mesenchymal stem cells(BMSC)of rat were induced osteoclast-like cells(OLC),the contrast lentivirus that marked Green fluorescent protein(GFP)was used to transfect the OLC.The fluorescent ratio of different multiplicity of infection(MOI)was observed under fluorescent microscope,and then Tartrate resistant acid phosphatase(TRAP)staining was used to identify the osteoclast-like cells.The most appropriate MOI value was selected and then divided into OLC,NFAT inhibitor(VIVIT),NFAT2iRNA lentivirus,control lentivirus groups,respectively.ResultsThe number of fluorescent cells was increased with elevating of MOI value after contrast lentivirus transfect osteoclast-like cells.The maximum fluorescent number was(41.00±9.19)/view when MOI=15.After different intervention,the mRNA expression of NFAT2 in NFAT inhibitor group and NFAT2iRNA lentivirus group were more decreased than those of OLC and control lentivirus groups(P<0.05).ConclusionsLentivirus could transfect osteoclast-like cells of rat.Furthermore,fluorescent transfect rate is increased with the rise of MOI value in a certain range.

【Key words】Lentivirus;Osteoclast-like cells;Nuclear factor of activated T cells

通訊作者：陳健(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272168)；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題資助項(xiàng)目(No.2012-CXB-32)

〔中圖分類號(hào)〕R3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0516-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.002