腦通湯含藥血清對缺氧/復氧大鼠海馬神經元抗氧化應激相關指標的影響

何　筑　況時祥　張樹森　鄒家莉　楊　燕　崔冬冰

(貴陽市第三人民醫院，貴州　貴陽　550002)

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腦通湯含藥血清對缺氧/復氧大鼠海馬神經元抗氧化應激相關指標的影響

何筑況時祥1張樹森1鄒家莉1楊燕2崔冬冰2

(貴陽市第三人民醫院，貴州貴陽550002)

〔摘要〕目的探討腦通湯通過海馬神經元抗氧化應激治療血管性癡呆(VD)的機制。方法培養大鼠原代海馬神經元及鑒定，取培養9 d的神經元，隨機分為正常細胞組、缺氧/復氧模型組、正常血清組、腦通湯大、中、小劑量含藥血清組。除正常細胞組以外，各組均置入(95%N2+5%CO2)混合氣體的三氣培養箱缺氧24 h再復氧2 h造模。采用MTT法檢測缺氧24 h和復氧2 h時間點海馬神經元活性并計算細胞存活率；實時熒光定量PCR法檢測海馬神經元核因子-E2-相關因子(Nrf)2、血紅素氧合酶亞型(HO)-1、醌氧化還原酶(NQO)1 mRNA的表達。結果MTT顯示：缺氧24 h：模型組的海馬神經元活性及存活率較正常細胞組明顯下降(P<0.05)，與正常血清組及腦通湯不同劑量含藥血清組比較無明顯差異(P>0.05)。復氧2 h：腦通湯不同劑量含藥血清組均較模型組明顯升高(P<0.05)，正常血清組較模型組無明顯差異(P>0.05)。實時熒光定量PCR結果顯示：腦通湯含藥血清能夠促進缺氧/復氧海馬神經元抗氧化應激相關基因Nrf2、HO-1、NQO1的表達(P<0.05)，并且腦通湯含藥血清大劑量組與中劑量組的上述3個基因水平明顯高于缺氧/復氧模型組(P<0.01)。結論腦通湯可通過上調抗氧化相關基因 Nrf2、HO-1、NQO1的表達，減輕海馬神經元缺氧/復氧損傷的氧化應激反應，從而保護大鼠海馬神經元缺氧/復氧損傷。

〔關鍵詞〕腦通湯；海馬神經元；缺氧/復氧；抗氧化應激

1貴陽中醫學院第二附屬醫院

2貴陽醫學院組織工程與干細胞實驗中心

第一作者：何筑(1986-)，女，碩士，主要從事血管性癡呆研究工作。

血管性癡呆(VD)是唯一可防治的癡呆，尤其是早期治療的可逆性備受關注〔1〕。目前，中醫藥在治療VD方面的優勢和特色日益突顯〔2〕。況時祥教授通過長期研究，篩選出黃芪、西洋參、水蛭、葛根、天麻等中藥，組成具有補氣升陽、化瘀通絡、潛降浮陽之功的腦通湯〔3〕。氧化應激是腦缺血再灌注損傷的重要環節，在缺血性腦損傷中發揮著重要作用〔4〕。已有研究報道，體外培養的神經細胞缺氧/復氧(H/R)過程中的病理生理改變類似于體內的缺血/再灌注損傷〔5〕。本實驗擬探討腦通湯對H/R海馬神經元抗氧化應激的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物出生24 h以內SD雄性大鼠，SPF 級，購自貴陽醫學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(黔)2012-0001。SD雄性SPF級大鼠，體重(200+20)g，購于重慶騰鑫生物技術有限公司，許可證號SCXK(渝)2012-0005。

1.1.2主要試劑與藥品L-谷氨酰胺；Neurobasal-A Medium；B27無血清添加劑、無糖DMEM均購于美國Gibco 公司；多聚-L-賴氨酸(PLL)、DMEM-F12培養基、0.25%胰酶、青、鏈霉素雙抗溶液均購于HyCLone；胎牛血清(FBS，杭州四季青)；二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液(北京中杉金橋公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗兔IgG、兔抗神經元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體均購于武漢博士德生物工程有限公司；MTT、二甲基亞砜、臺盼藍染液(Sigma)；Trizol(批號1596-026，invitrogen公司)；SYBR Green PCR 試劑盒(批號K0223，Thermo公司)；逆轉錄試劑盒(批號K1622，Fermentas公司)；異丙醇、無水乙醇、氯仿均購于國藥集團化學試劑公司；水合氯醛(天津市富宇精細化工有限公司)；腦通湯主要成分(黃芪40 g、西洋參8 g、天麻20 g、水蛭24 g、葛根60 g)均由貴陽中醫學院第二附屬醫院中藥房提供。

1.1.3主要儀器設備SW-CJ-1D超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；LD4-2低速離心機 (北京醫用離心機廠)；二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；Galaxy170R三氣培養箱(英國New Brunswick)；CTH4-200熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；TE2000倒置顯微鏡(日本Nikon)；MIAS 圖像分析系統(四川大學圖像圖形研究所提供)，ABI-7300Real-time檢測儀(ABI公司)；TG-16M低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；K30旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠)；PRO200電動勻漿機(FLUKO)；Tanon 2500R全自動數碼凝膠成像分析系統、Tanon HE-120水平電泳槽、Tanon EPS300電泳儀均為(上海天能公司)，K2800核酸檢測儀(北京凱恩公司)。

1.2方法

1.2.1腦通湯含藥血清的制備

1.2.1.1腦通湯藥物的制備腦通湯每劑方藥152 g，加水500 ml煎制，醇沉提取，高溫消毒，制成浸膏含生藥量為3.04 g/ml(大劑量腦通湯組)、1.52 g/ml(中劑量腦通湯組)、0.76 g/ml(小劑量腦通湯組)，4℃凍存備用。

1.2.1.2分組SD大鼠60只，隨機分為正常對照組和大、中、小劑量腦通湯組每組15只。參照《藥理實驗方法學》〔6〕換算出灌胃給藥量：大、中、小劑量腦通湯組分別為每日15.2、7.6、3.8 g/kg，正常對照組每日灌服生理鹽水10 ml/kg〔7〕，2次/d，連續灌胃4 d。

1.2.1.3腦通湯含藥血清采集末次給藥2 h后，10%水合氯醛(0.33 ml/100 g) 麻醉，無菌股動脈采血，常溫靜置4 h，3 000 r/min離心20 min，分離血清，混勻同組血清，0.22 μm濾膜過濾除菌，56℃水浴箱中滅活30 min，標記制得的血清分別稱為正常血清及腦通湯大、中、小劑量含藥血清，-20℃保存備用。

1.2.2海馬神經元原代培養及鑒定 參考文獻〔8〕方法。選擇10只出生24 h以內SD大鼠，脫頸處死，浸泡于75%酒精中1 min，斷頭，于顯微鏡下剝離雙側海馬，放入預冷的D-hank液中沖洗2~3遍。將組織剪成1 mm3左右大小的組織塊，用移液槍轉移至15 ml離心管中，按照1∶2比例加入0.25%胰蛋白酶。于37℃，5%CO2培養箱中消化15 min，每5 min晃蕩一次。消化完畢加入同等體積的種植培養基(89%DMED-F12、10%胎牛血清和1%雙抗)，終止消化5 min，再200目篩網過濾制成細胞懸液，800~1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量種植培養基，吹打混勻制成細胞懸液。放入培養箱差速貼壁1 h，收獲貼壁速度較膠質細胞慢的神經元，臺盼藍拒染試驗，血球計數板顯微鏡下計數胞體透亮的活細胞，按1.0×105~1.0×106個/ml的密度接種于PLL包被過的六孔板中，置于37℃，5%CO2培養箱內孵育。24 h后，第一次全量換成無血清培養基(97%Neurobasal、2%B27和1% L-谷氨酰胺)繼續孵育，每隔2~3 d換液1次。取生長9 d的海馬神經用NSE做免疫熒光鑒定其純度。

1.2.3海馬神經元分組取生長9 d的海馬神經元，隨機分為正常細胞組：正常海馬神經元；H/R模型組：海馬神經元+H/R；正常血清組：海馬神經元+H/R+正常血清組；腦通湯大劑量含藥血清組：海馬神經元+H/R+腦通湯大劑量含藥血清組；腦通湯中劑量含藥血清組：海馬神經元+H/R+腦通湯中劑量含藥血清組；腦通湯小劑量含藥血清組：海馬神經元+H/R+腦通湯小劑量含藥血清組。

1.2.4海馬神經元H/R模型的建立10% 正常血清及10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清培養基的配制：分別用89%無胎牛血清的DMEM培養基、1%雙抗和10% 正常血清及10%不同劑量含藥血清配制而成。

除正常細胞組以外均參考文獻〔9〕，根據本課題的具體要求稍加改良，制備細胞H/R模型：用無糖DMEM洗滌2次，H/R模型組換液無血清培養基，其余各組于I/R時依次加入無FBS配制而成的含10%SD大鼠正常血清及含10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清培養基，將這5組全置入37℃三氣培養箱，持續通入(95%N2+5%CO2)混合氣體，流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h。H/R模型組換液無血清培養液繼續培養，其余四組全量換液相應含10%SD大鼠正常血清及10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清培養基，再將這5組放回37℃、5%CO2培養箱持續復氧2 h。正常細胞組用無血清培養基正常培養26 h，不做任何處理。

1.2.5四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定海馬神經元的活力將海馬神經元以5×105/ml的細胞密度接種于96孔板中，取生長9 d的海馬神經元分別進行缺氧24 h和復氧2 h時間點造模，吸棄96孔板各孔液體，每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl，混勻，37℃孵育4 h。棄上清液，每孔加100 μl的二甲基亞砜，均勻振蕩10 min，用酶標儀(微量波長為570 nm)處讀取吸光度值(OD值)，用OD值以表示神經元活性。細胞存活率以正常細胞組OD值均數為100%，計算公式：細胞存活率(%)=各孔OD值/正常組OD值均數×100%。

1.2.6實時熒光定量PCR法檢測海馬神經元核因子-E2-相關因子(Nrf)2、血紅素氧合酶亞型(HO)-1、醌氧化還原酶(NQO)1 mRNA的表達各引物均由上海基爾頓生物科技有限公司設計。Nrf-2 mRNA，上游引物：5′GACTCAAATCCCACCTTGAAC 3′，下游引物：5′CTTTACACAGGGACAGATCAC3′，擴增長度166 bp；HO-1 mRNA，上游引物：5′GGTCCTCACACTCAGTTTC 3′，下游引物：5′CAGGCATCTCCTTCCATTC 3′，擴增長度226 bp；NQO1 mRNA，上游引物：5′GGAAGAAGCGTCTGGAGACTG 3′，下游引物：5′TGGTTGTCGGCTGGAATGG 3′，擴增長度184 bp，內參β-actin mRNA，上游引物：5′GTCGGTGTGAACGGATTTG 3′，下游引物：5′TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3′，擴增長度181 bp。按Trizol試劑說明書提取海馬神經元總RNA，將細胞總RNA逆轉錄合成cDNA，將逆轉錄的cDNA按照SYBR Green PCR 試劑盒說明操作進行實時熒光定量RT-PCR反應(兩步法)進行目的基因和內參基因的實時熒光定量PCR反應。反應總體積25 μl，PCR反應參數：預變性，95℃，10 min，變性 95℃，15 s，退火60℃，45 s，延伸60℃，1 min，總共40次循環。反應結束時儀器自動顯示達到閾值時的循環圈數(CT)值。由電腦自帶軟件與實時熒光定量PCR反應軟件ABI Prism 7300SDS Software自動輸出結果及PCR擴增產物生成曲線，以內參β-actin mRNA CT值標化Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA的 CT值，運用2-△△CT方法計算樣本目的基因相對表達量〔10〕。公式：樣品目的基因△CT=樣品目的基因CT值-內參基因CT值；△△CT =樣品目的基因△CT值-對照組△CT值。

1.3統計學方法應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、t檢驗。

2結果

2.1海馬神經元形態學觀察及鑒定倒置顯微鏡下觀察：24 h后細胞幾乎貼壁并有細小的突起伸出，長短不一。培養3 d后，細胞形態多樣化，以不規則形為主，突起較前明顯增多增粗并延長，有逐漸靠攏趨勢，有部分交織成稀疏的網狀突起聯系。培養5~7 d，神經元胞體明顯增大豐滿，趨于成熟，突起及分枝進一步增長增粗靠近明顯，相互交織成較稠密的神經突起網絡。第9~10天后神經元胞體增大飽滿，完全成熟，神經元突起間更加緊密連接成致密網絡狀，可見少許的細胞碎片。NSE免疫熒光鑒定：神經元胞體飽滿，軸突明顯趨于成熟。NSE免疫熒光染色后，陽性細胞胞體及軸突在熒光顯微鏡下呈亮綠色，計算海馬神經元純度為 94.5%+2.5%。見圖1，圖2。

2.2腦通湯對海馬神經元缺氧24 h及復氧2 h后活性及存活率的影響組間比較：缺氧24 h：H/R模型組、腦通湯不同劑量含藥血清組、正常血清組的海馬神經元活性及存活率均較正常細胞組明顯下降(P<0.05)，這五組間比較無明顯差異(P>0.05)；復氧2 h：H/R模型組、腦通湯不同劑量含藥血清組、正常血清組的海馬神經元活性及存活率仍均較正常細胞組明顯下降(P<0.05)，腦通湯不同劑量含藥血清組均較模型組明顯升高(P<0.05)，正常血清組較模型組無明顯差異(P>0.05)。組內比較：H/R模型組、腦通湯不同劑量含藥血清組、正常血清組的海馬神經元活性及存活率均較缺氧24 h明顯升高(P<0.05)。見表1。

圖1　原代海馬神經元形態學觀察(倒置顯微鏡，×400)

圖2　NSE免疫熒光鑒定(熒光顯微鏡，×400)

組別缺氧24h活性(OD值)存活率(%)復氧2h活性(OD值)存活率(%)正常細胞組0.766±0.142100±00.778±0.132100±0H/R模型組0.324±0.0641)57.64±5.241)0.357±0.07561)3)64.54±5.172)3)正常血清組0.329±0.0741)59.47±5.371)0.387±0.0822)3)65.87±5.342)3)腦通湯大劑量含藥血清組0.344±0.0871)59.45±6.871)0.754±0.08611)3)83.58±6.952)3)腦通湯中劑量含藥血清組0.359±0.0481)61.04±6.551)0.672±0.0781)3)76.28±6.952)3)腦通湯小劑量含藥血清組0.377±0.0741)62.37±5.381)0.615±0.0841)3)67.54±5.472)3)

與同一時間點正常細胞組比較：1)P<0.05；與同一時間點模型組比較：2)P<0.05；與缺氧24 h比較：3)P<0.05

2.3腦通湯含藥血清對海馬神經元H/R后Nrf-2、HO-1及NQO1基因的影響實時熒光定量PCR顯示：與正常細胞比較，H/R模型組Nrf-2、HO-1、NQO1 mRNA的表達量明顯下降(P<0.05)。與H/R模型組比較，正常血清組、腦通湯大、中、小劑量含藥血清組的Nrf-2、HO-1、NQO1 mRNA的表達量呈現上升趨勢(P<0.05)，其中腦通湯大、中劑量含藥血清組上升最顯著(P<0.01)。見表2。

表2　各組Nrf-2、HO-1、NQO1 mRNA表達水平比較

與正常細胞組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

氧化應激是指機體氧化與抗氧化物質失衡從而引起的組織細胞的氧化損傷〔11〕，參與并介導缺血再灌注損傷的重要環節〔12〕，可導致神經細胞凋亡、血腦屏障損傷及腦水腫〔13〕。缺血性腦血管病是VD的主體病因〔14〕，腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病發生發展的重要重要環節，因此可見，氧化應激是參與腦缺血所致VD發病的重要病理生理基礎。Nrf2、HO-1、NQO1是參與氧化應激與抗氧化應激反應的常見分子標志物。 目前，在眾多參與氧化應激反應的防御性轉導通路之中，Nrf2/ARE是最重要的氧化應激通路。Nrf2不僅是氧化應激的感受器，還是細胞氧化應激反應中的核心轉錄因子，生理狀態下，Nrf2轉錄被負性調節蛋白Keap1抑制，在機體受到氧化應激時，導致Nrf2與Keap1解離而活化進入細胞核，與抗氧化反應元件(ARE)結合相互作用，誘導下游靶基因，如：Ⅱ相解毒酶基因：NQO1、抗炎因子類基因：HO-1等表達〔15〕。因此，激活Nrf2基因的表達是對抗氧化應激反應的關鍵。HO-1為誘生型，廣泛分布于全身組織細胞中，可以通過上調體內HO-1的表達，發揮其腦保護作用。袁野等〔16〕研究等證實：通過上調小鼠腦缺血再灌注損傷中 HO-1蛋白表達，從而提高機體抗氧化水平，可以保護缺血再灌注后的腦損傷。邵建林等〔17〕實驗進一步證實，可以通過七氟烷誘導大鼠海馬組織HO-1基因的表達，保護缺血再灌注損傷的海馬神經元。由此可見，激活HO-1的高表達，是保護缺血再灌注損傷的海馬神經元的一種重要途徑。黃小平等〔18〕進一步證實，在腦缺血/再灌注后，通過黃芪甲苷分別與三七的三種有效成分配伍可以有效激活Nrf2/HO-1信號通路，促進Nrf2的合成及相細胞內核轉位，激活并促進下游抗氧化靶基因HO-1等的表達，從而減輕小鼠腦缺血/再灌注后腦組織氧化應激損傷。NQO1是氧化應激Nrf2/ARE通路激活的重要下游靶基因，屬于Ⅱ相解毒酶基因。在缺血再灌注損傷中，可以通過激活Nrf2/ARE信號通路，上調Nrf2、NQO1蛋白分子的表達，增強腦組織抗氧化反應，從而保護大鼠腦缺血再灌注損傷的神經細胞〔19〕。

本課題組前期臨床及實驗證實〔3〕，本方不僅可以改善VD早期患者認知功能，改善VD大鼠學習及記憶能力，還可減輕VD大鼠海馬CA1區的神經細胞及椎體細胞凋亡。本文結果進一步說明腦通湯含藥血清對H/R損傷下的海馬神經元具有保護作用，提示腦通湯干預海馬神經元，缺氧24 h復氧2 h是最佳的干預時間。實時熒光定量PCR結果說明，H/R損傷后細胞處于氧化應激狀態，此時激活Nrf2通路，進而誘導下游靶基因HO-1、NQO1 mRNA較正常細胞組升高；細胞經過腦通湯含藥血清干預后，腦通湯不同劑量含藥血清組上述3個基因的表達又較模型組明顯增高，提示腦通湯對H/R模型敏感，能誘導激活Nrf2通路，進而誘導下游靶基因HO-1、NQO1 mRNA表達升高，增強細胞對抗氧化應激反應的耐受性。

本研究結果顯示，腦通湯對大鼠海馬神經元H/R損傷具有保護作用，其作用機制是通過激活海馬神經元Nrf2通路，誘導下游靶基因HO-1、NQO1mRNA的進一步表達，為VD的臨床治療提供進一步實驗基礎及理論依據。

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〔2015-05-28修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of Naotong soup medicinal serum on anti-oxidative stress-related indicators of hippocampal neurons in rats after hypoxia/reoxygenation

HE Zhu,KUANG Shi-Xiang,ZHANG Shu-Sen，etal.

Third People's Hospital of Guiyang，Guiyang 550000，Guizhou，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate Naotong soup treated vascular dementia by hippocampal neurons against oxidative stress.MethodsPrimary hippocampal neurons were cultured and indentified. Neurons cultured for 9 days were randomly divided into normal cell, hypoxia/reoxygenation(H/R)model, normal serum, large, medium and small doses of Naotong soup medicinal serum groups.The activity and the survival rate of neurons both at 24 hours after hypoxia and 2 hours after reoxygenation were evaluated by colorimetric MTT assay. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expressions of nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor(Nrf2)，Heme Oxygenase(HO)-1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase(NQO1)mRNA.ResultsCompared with those of normal cell group，hippocampal neuronal activity and the survival rate of model groups were significantly lower after hypoxia 24 h(P<0.05), between normal serum group and different dose of Naotong soup medicinal serum groups, they had no significant differences (P>0.05). Compared with those of model group, they had significantly increased after reoxygenation 2 h in different dose of Naotong soup medicinal serum groups(P<0.05)and in normal serum group they had no significant difference(P>0.05). Naotong soup medicinal serum promoted the expressions of Nrf2, HO-1, NQO1 of hippocampal neurons(P<0.05),and these three genes were significantly higher than those of model group(P<0.05).ConclusionsNaotong soup could increase the expressions of Nrf2, HO-1 and NQO1 and reduce oxidative stress of hippocampal neurons after H/R. So it could protect hippocampal neurons in rats after H/R.

【Key words】Naotong soup; Hippocampal neurons; Hypoxia / reoxygenation; Antioxidative stress

通訊作者：況時祥(1962-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事中西醫結合防治老年癡呆臨床與基礎研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81160490)

〔中圖分類號〕R74

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0526-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.006