枸芪復腎丸對IgA腎病模型大鼠MMP-9、TIMP-1的影響

鄒　迪　張守琳　王銀萍　王宏安　崔成姬

(長春中醫藥大學附屬醫院腎病科，吉林　長春　130021)

?

枸芪復腎丸對IgA腎病模型大鼠MMP-9、TIMP-1的影響

鄒迪張守琳王銀萍王宏安崔成姬

(長春中醫藥大學附屬醫院腎病科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討枸芪復腎丸治療IgA腎病的療效及作用機制。方法72只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、血尿膠囊組、枸芪復腎丸高、中、低劑量組。采用口服BSA和尾靜脈注射LPS方法建立IgA腎病大鼠模型。觀察給藥8 w后大鼠各時相尿紅細胞計數、24 h尿蛋白定量(UTP)；腎組織基質金屬蛋白酶(MMP)-9、金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1的含量變化。結果給藥后各組大鼠尿紅細胞計數及UTP均有所下降，其中枸芪復腎丸中劑量組明顯優于血尿膠囊組(P<0.05)；與空白組比，模型組大鼠血清及腎組織中MMP-9含量明顯降低，而TIMP-1含量升高，MMP-9/TIMP-1下降(P<0.05)；給藥后，治療組MMP-9含量明顯升高，TIMP-1含量明顯降低，MMP-9/TIMP-1升高，其中枸芪復腎丸中劑量組優于血尿膠囊組(P<0.05)。結論枸芪復腎丸能降低IgA腎病血尿、蛋白尿。

〔關鍵詞〕枸芪復腎丸；IgA腎病；MMP-9；TIMP-1

第一作者：鄒迪(1980-)，女，主治醫師，主要從事腎病研究。

IgA腎病是臨床常見的原發性腎小球疾病之一，以腎臟病理顯示以IgA為主的免疫復合物沉積在腎小球系膜區為特征〔1〕。在我國和全世界范圍內的發病率均較高，在亞洲占腎活檢發病率的47.2%。有報道稱其20年終末期腎病發生率為15%~40%〔2〕。枸芪復腎丸是我院的院內制劑，用于治療IgA腎病療效顯著，本文就進一步研究該藥治療IgA腎病的療效作用機制進行研究。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物選擇6周齡健康清潔級雄性Wistar大鼠72只，體重160~200 g，由吉林大學白求恩醫學院動物實驗室提供。

1.1.2實驗儀器、試劑及藥物熒光顯微鏡TXM-500C，上海天省儀器有限公司；全自動酶標儀318C，上海昨非實驗室設備有限公司；組織破碎機BIO-950，上海般諾生物科技有限公司。基質金屬蛋白酶(MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP-1)ELISA檢測試劑盒，由上海信裕生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白、脂多糖，美國sigma公司；熒光素標記兔抗大鼠IgA抗體，北京博奧森生物技術有限公司。血尿膠囊由鄭州市協和制藥廠生產(國藥準字Z20003007)；枸芪復腎丸，長春中醫藥大學附屬醫院制劑室〔長衛藥制字(96)1413號〕。

1.2實驗方法

1.2.1造模方法大鼠購買后先飼養1 w，以適應環境，隨機分為空白組、模型組、血尿膠囊組、枸芪復腎丸高、中、低劑量組。1 w后參照陸慧渝等〔3〕報道的方法制備動物模型，于第9周每組各選取2只，取腎組織行光鏡檢查驗證模型是否成功。

1.2.2分組及給藥驗證模型成功后，給予血尿膠囊對照組每日灌胃血尿膠囊0.547 g/kg；給予枸芪復腎丸高劑量組5.625 g·kg-1·d-1灌胃、中劑量組2.813 g·kg-1·d-1灌胃、低劑量組1.406 g·kg-1·d-1灌胃；空白組及模型組每天僅給予生理鹽水灌胃，4 ml/只。共給藥8 w。

1.2.3觀測指標觀察大鼠的一般狀態，包括：體重、毛發、排尿的顏色及尿量，分別于第0、4、6、8、10、12、14、16周末，用代謝籠收集24 h尿液，觀察尿液顏色，記錄尿量、肉眼血尿次數及程度，取部分尿液行24 h尿蛋白測定，應用尿沉渣法檢測尿紅細胞計數，采用ELISA法分別檢測腎組織中MMP-9和TIMP-1含量(詳見試劑盒說明)。

1.3統計學方法應用SPSS19.0軟件進行分析單因素方差分析和多因素方差分析。

2結果

2.1一般情況實驗過程中給予四氯化碳溶液及脂多糖后造模組共死亡5只，后每籠選取2只用于驗證模型是否成功。空白組大鼠在整個實驗過程中，狀態始終良好，無明顯異常。造模4 w各組大鼠出現進食和活動減少，毛色晦暗，體重下降、腹瀉及尿色變深；給藥后各治療組大鼠一般狀況明顯好轉，體重有所增加。

2.2各組大鼠尿紅細胞計數比較與空白組比較，其余各組大鼠6 w后尿紅細胞計數開始升高，且差異隨應用藥物時間的延長逐漸增大；與模型組比較，血尿膠囊組與枸芪復腎丸組尿紅細胞均明顯減少，組間比較枸芪復腎丸組下降程度更加明顯(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠24 h尿蛋白定量變化的比較與空白組比較，其余各組大鼠6 w后24 h尿蛋白定量開始出現差異，且差異隨應用藥物時間的延長逐漸增大；與模型組比較，血尿膠囊組與枸芪復腎丸組24 h尿蛋白定量均明顯減少，組間比較枸芪復腎丸組下降程度更為明顯(P<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠的腎組織中MMP-9、TIMP-1含量變化的比較與空白組比較，各組腎組織中MMP-9、TIMP-1有明顯變化(P<0.01)。與模型組比較，血尿膠囊組及枸芪復腎丸組大鼠的表達有較明顯差異(P<0.05)，組間比較，枸芪復腎丸組改變更加明顯(P<0.05)。MMP-9在空白組大鼠及治療組大鼠中含量較高，而模型組含量較少，TIMP-1在空白組大鼠及治療組大鼠中含量較低，而模型組含量較高。與空白組比較，各組腎組織中MMP-9/TIMP-1有明顯變化(P<0.05)。與模型組比較，枸芪復腎丸組及血尿膠囊組大鼠的表達有較明顯差異(P<0.05)，枸芪復腎丸組下降程度更加顯著(P<0.05)。見表3。

表1　治療前后各組大鼠各時相尿紅細胞計數的比較±s,n=12)

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05；與血尿膠囊組比較：4)P<0.05；與枸芪復腎丸中劑量組比較：5)P<0.05，表2同

表2　治療前后各組大鼠24 h尿蛋白定量的比較

表3　各組大鼠腎組織中MMP-9、TIMP-1含量(pg/ml)及

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與血尿膠囊組比較：3)P<0.05；與枸芪復腎丸中劑量組比較：4)P<0.05

3討論

現代研究認為：IgA 腎病是多種原因共同作用的結果〔4〕，在IgA腎病發病過程中多種因素可以導致腎小球硬化以及腎小管間質纖維化，最終導致腎衰竭。細胞外基質(ECM)的生成失衡和降解失衡可導致ECM過量積聚，導致腎小球硬化和腎間質纖維化，從而導致腎功能受損。TIMP是調節ECM生成和降解平衡的主要因素之一。MMP-9能夠降解ECM的膠原和非膠原成分；同時，MMP還受TIMP1和胞漿原性活性抑制物-1(PAI-1)的抑制。正常情況下ECM在這些因素的調解下處于動態平衡，MMPs/TIMPs失衡是導致ECM降解異常的重要環節。研究表明，MMP-9/TIMP-1的異常表達在腎小球纖維化的進展中起重要作用。在慢性間質纖維化時，則有小管基底膜的增厚和小管間質ECM的擴增，其中小管上皮細胞對上述各因素的影響可能占有重要地位〔5〕。小管上皮細胞對ECM的影響還可以通過調節MMP的活性來實現。高糖引起近曲小管上皮細胞外Ⅳ型膠原(ColⅣ)和纖維連接蛋白(FN)的增加與TIMP1和TIMP2的增加有關〔6〕。試驗以證明低氧引起的ECM增加與MMP2活性降低和TIMP1的增加有關。除小管上皮基底膜增厚外，有時可以見到基底膜的斷裂，這與ECM被MMP降解有關。因此可推測，MMP-9的含量與IgA模型大鼠的病情呈正相關，TIMP-1的含量與IgA模型大鼠的病情呈負相關。因此，可以通過調節MMP-9/TIMP-1 在腎臟組織中的表達來改善腎小球纖維化的病變程度。

目前研究認為，由IgA腎病引發腎小球源性血尿、蛋白尿大約在10~20年可進展為終末期腎病。因此，積極控制血尿是不容忽視的問題。中醫藥治療IgA腎病取得了很好的療效，已經被大量臨床實踐證明〔7~10〕。

枸芪復腎丸是我院名老中醫的經驗方，是根據多年臨床經驗研制而成，在臨床上效果較好，尤其是用于IgA腎病，可顯著降低血尿、蛋白尿。方中枸杞子、黃芪為君藥，黃芪與枸杞子同用既能補腎健脾有利于長養腎精精髓，同時能利尿祛濕。臣以生地黃、女貞子、旱蓮草、二薊既能助君藥清熱涼血止血以治標，同時又能補腎養陰以培其本；佐使藥為槐花、赤芍、當歸、益母草、白茅根、牡丹皮、梔子、大黃，可助君藥涼血止血而不留瘀。諸藥合用，攻補兼施，共奏補腎健脾以扶正，清熱涼血利濕，化瘀通絡以祛邪的作用，使血止而不留瘀。

本實驗證明MMP-9、TIMP-1的表達與IgA腎病相關。經枸芪復腎丸治療后，大鼠IgA腎病癥狀明顯改善，腎臟及血清中MMP-9、TIMP-1變化明顯改善，揭示了枸芪復腎丸可能通過調節MMP-9、TIMP-1的表達，從而調節MMP-9/TIMP-1，起到治療作用。

4參考文獻

1王海燕.腎臟病學臨床概覽〔M〕，北京：人民衛生出版社；2008：141-5.

2Barratt J，Feehally J.IgA nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol，2005;16(7)：2088-97.

3陸慧渝，張巧玲，蔣小云,等.IgA腎病大鼠模型的建立〔J〕.中國誤診學雜志，2011;11(6)：1264-7.

4Wada J，Sngiyama H，Makino H.Pathogenesis of IgA nephropathy〔J〕.Semin Nephrol，2003;23(6)：556-63.

5師鎖柱，張雪光，陳香美.MMP-9/IgA和TIMP-1/IgA在IgA腎病患者腎組織中的共表達及意義〔J〕.軍醫進修學院學報，2011;32(12)：1269-73.

6Lam S，Verhagen NA，Strutz F，etal.Glucose-induced fibronectin and collagen type Ⅲ expression in renal fibroblasts can occur independent of TGF-beta l〔J〕.Kidney Int，2003;63(3)：878-88.

7萬啟軍，石成鋼，何永成，等.益腎湯聯合強的松與依那普利對IgA腎病小鼠腎MMP-9、TIMP-1表達的影響〔J〕.中山大學學報(醫學科學版)，2008;29(4)：412-7.

8王曉星，涂元寶，劉賢亮，等.滋陰活血方治療IgA腎病陰虛血瘀證60例〔J〕.安徽中醫藥大學學報，2014；33(4)：38-41.

9陳香美，陳以平，周柱亮，等.腎樂膠囊治療IgA腎病肺脾氣虛證患者的前瞻性多中心隨機對照臨床研究〔J〕.中國中西醫結合雜志，2006；26(12)：1061-5.

10陳香美，陳建，陳以平，等.腎華片治療IgA腎病(氣陰兩虛證)多中心隨機對照臨床觀察〔J〕.中國中西醫結合雜志，2007；27(2)：101-5.

〔2015-03-27修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：張守琳(1969-)，女，主任醫師，主要從事腎病研究。

基金項目：吉林省科技廳資助項目(20130206071YY；2015101214JC)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(2014第65號)

〔中圖分類號〕R28

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0549-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.014