大鼠陰莖組織中DDAH1和神經(jīng)型一氧化氮合酶的變化及其對勃起功能障礙的影響

王建華　岳建華　張　輝　張克勤　姜　斌　傅　強

(山東大學附屬省立醫(yī)院，山東　濟南　250021)

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大鼠陰莖組織中DDAH1和神經(jīng)型一氧化氮合酶的變化及其對勃起功能障礙的影響

王建華岳建華1張輝張克勤姜斌傅強

(山東大學附屬省立醫(yī)院，山東濟南250021)

〔摘要〕目的探討老年大鼠陰莖組織中不對稱二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)和神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)的變化對老年性勃起功能障礙(ED)的影響。方法隨機抽取3月齡與18月齡大鼠作為青年組與老年組，檢測兩組大鼠基礎陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)；電鏡觀察兩組大鼠陰莖海綿體組織細胞形態(tài)學差異；采用ELISA方法檢測兩組大鼠陰莖組織中不對稱二甲基精氨酸(ADMA)濃度；采用Western印跡檢測大鼠陰莖組織中DDAH1及nNOS表達水平。結(jié)果老年組與青年組基礎ICP無明顯差異(P>0.05)，注射罌粟堿后老年組ICP明顯低于青年組ICP(P<0.05)；電鏡發(fā)現(xiàn)老年組陰莖海綿體組織中內(nèi)皮下纖維化明顯；內(nèi)皮細胞細胞器減少，線粒體聚集、腫脹明顯，細胞核變形、固縮時見。青年組組織內(nèi)未見明顯異常。ELISA發(fā)現(xiàn)老年組陰莖海綿體內(nèi)ADMA濃度明顯高于青年組(P<0.01)。Western印跡發(fā)現(xiàn)老年組陰莖組織中DDAH1與nNOS的表達明顯低于青年組(P<0.05)。結(jié)論增齡對陰莖組織中DDAH1和nNOS的影響是引起老年性勃起功能障礙的重要原因。

〔關(guān)鍵詞〕增齡；勃起功能障礙；二甲基精氨酸二甲胺水解酶1；神經(jīng)型一氧化氮合酶；不對稱二甲基精氨酸

1沂水中心醫(yī)院

第一作者：王建華(1988-)，男，在讀碩士，主要從事勃起功能障礙相關(guān)研究。

目前研究認為老年性勃起功能障礙(ED)主要與陰莖組織內(nèi)一氧化氮(NO)濃度降低有關(guān)〔1〕。NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生，其中神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)在NO合成過程中起重要作用〔2〕。而不對稱二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH1)的代謝產(chǎn)物可以抑制NOS的活性進而間接影響NO的合成〔3〕。本研究通過檢測大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)和陰莖組織中DDAH1和nNOS的表達，探討老年ED的發(fā)病機制。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器隨機抽取18月齡及3月齡清潔級雄性SD大鼠(成都達碩生物科技有限公司提供)各10只，分別作為老年組和青年組。DDAH1抗體(兔IgG，Santa Cruz，美國)、nNOS抗體(兔IgG，Santa Cruz，美國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒，PVDF膜，RIPA，PMSF，ECL發(fā)光試劑盒(Millipore，美國)，大鼠睪酮酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Bioswamp，中國)，酶標儀(BIO-TEK，美國)，凝膠成像儀(LAS-4000mini，美國)，透射電鏡(JEM JEOL-1200EX，日本)，壓力換能器，BL-420V生物機能實驗系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1陰莖海綿體內(nèi)壓測定大鼠稱重后給予2%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射，等待麻醉滿意，取仰臥位固定四肢，在下腹正中切開約3 cm縱行切口，分離陰莖及球海綿體肌。游離周圍皮膚。取兩個六號靜脈針，一個充滿肝素后與壓力換能器相連，另一個連接1 ml裝滿3 g/ml的罌粟堿的注射器。于陰莖頭體交界處平行將兩個針頭刺入海綿體兩側(cè)。用37℃生理鹽水浸濕紗布覆蓋切口，5 min更換一次紗布，使切口處保持恒溫。用BL-420V生物機能試驗系統(tǒng)記錄每只大鼠的基礎ICP，然后注入0.14 ml罌粟堿，記錄ICP變化。

1.2.2收集標本大鼠心臟取血2 ml置于離心管中，4℃保存，待血液凝固后1 500 r/min離心15 min，上清液移至新EP管中，放入-80℃冰箱備用。處死大鼠后從陰莖根部取下陰莖組織，各修剪出1 mm×1 mm×1 mm立方體，放入電鏡組織固定液中，剩余組織放入-80℃冰箱備用。

1.2.3電鏡樣品制備組織塊先經(jīng)2%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定1 h，PBS漂洗后梯度丙酮脫水，然后Epon812環(huán)氧樹脂包埋，切片機切片，用醋酸雙氧鈾-檸檬酸雙重染色，透射電鏡觀察。

1.2.4ELISA檢測ADMA將血清依次進行標準品稀釋，加樣，溫育，洗滌，加酶，溫育，洗滌，顯色，終止，測定(均嚴格按照試劑盒說明書操作)。

1.2.5Western印跡檢測DDAH1、nNOS的表達取約100 mg陰莖海綿體組織于生理鹽水中，剪碎洗凈后加入PMSF與RIPA比例為1∶100的混合液適量，勻漿器研磨后于冰上靜置5 min。離心機內(nèi)20 000 r/min 4℃離心30 min，將上清吸到新EP管中，BCA法測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后金屬浴變性。配置SDS-PAGE凝膠，吸取40 μg總蛋白，30 V電泳60 min壓線后改為100 V電泳約90 min。100 V轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉1 h，4℃冰箱內(nèi)一抗(1∶200)孵育過夜。洗膜后加入二抗室溫孵育2 h。再次洗膜，在成像儀中顯影，比較各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件行獨立樣本t檢驗。

2結(jié)果

2.1ICP測定老年組與青年組基礎ICP無明顯差異〔(9.84±1.63)vs(10.66±1.66)mmHg,P>0.05〕；注射罌粟堿后兩組大鼠ICP均升高，老年組ICP明顯低于青年組〔(33.46±5.37)vs (39.71±3.67)mmHg,P<0.05〕。

2.2電鏡觀察陰莖海綿體組織電鏡下可見老年組大鼠陰莖海綿體組織纖維化明顯，內(nèi)皮細胞內(nèi)細胞器減少，線粒體聚集、空泡化多見，細胞核固縮、核膜變形、異染色質(zhì)邊集時見。見圖1。

2.3ADMA測定老年組陰莖海綿體內(nèi)ADMA濃度為(61.04±4.19)μmol/g，青年組ADMA為(42.85±4.09)μmol/g。

2.4陰莖海綿體組織內(nèi)DDAH1、nNOS表達Western印跡結(jié)果顯示老年組大鼠陰莖組織內(nèi)DDAH1〔(0.90±0.06)vs(1.12±0.17)〕和nNOS〔(0.83±0.08)vs(1.07±0.11)〕的表達明顯低于青年組。見圖2。

圖1　陰莖海綿體組織電鏡觀察(×20 000)

圖2　兩組大鼠陰莖組織nNOS、DDAH1表達比較

3討論

ED是目前最常見的男科疾病之一，其發(fā)病率隨著年齡的增長逐漸增加。據(jù)報道〔4〕，50歲以下ED的發(fā)病率不足10%，而60歲以上人群發(fā)病率超過20%。研究發(fā)現(xiàn)〔5〕ED的發(fā)病主要與陰莖組織中NO生成減少有關(guān)。NO是一種非腎上腺能非膽堿能的神經(jīng)遞質(zhì)，在介導陰莖海綿體動脈平滑肌松弛的過程中發(fā)揮主要作用〔6〕。NO主要由NOS分解左旋精氨酸生成。nNOS是NOS的一個亞型，對勃起過程的啟動發(fā)揮主要作用〔7〕。nNOS合成的神經(jīng)源性NO通過增加海綿體組織內(nèi)cGMP含量進而通過一系列復雜反應使陰莖迅速達到勃起狀態(tài)〔8〕。DDAH1主要分布在nNOS表達的區(qū)域〔9〕，其底物ADMA是NOS的競爭性抑制劑，可以通過降低NOS的活性減少NO的生成〔3〕。DDAH1是ADMA的分解代謝酶，超過70%的ADMA是由DDAH1分解代謝的〔10〕。因此nNOS和DDAH1兩者表達變化均可影響NO的生成，進而影響陰莖發(fā)生ED。

研究發(fā)現(xiàn)，DDAH1與血管性疾病〔11〕以及血管病變引起的ED〔12〕有密切關(guān)系，但其對老年性ED的影響及其機制尚未清楚。本研究通過對比老年大鼠與青年大鼠罌粟堿誘導的ICP發(fā)現(xiàn)，老年大鼠ICP明顯低于青年組。而這一變化與陰莖海綿體內(nèi)DDAH1表達呈正相關(guān)，因此本研究認為DDAH1可能降低老年大鼠ED。本研究還發(fā)現(xiàn)老年大鼠陰莖海綿體內(nèi)ADMA的濃度升高，ADMA在陰莖組織內(nèi)積聚，與NOS上的位點結(jié)合，競爭性抑制了NOS的活性，最終使NO生成減少。這一結(jié)果進一步驗證了DDAH1對勃起功能的影響。Sydow等〔13〕研究證明DDAH1轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)ADMA濃度與對照組相比明顯下降，進而可以提高NOS活性，增加NO的生成，改善勃起功能障礙。本研究還通過Western印跡方法比較老年大鼠與青年大鼠陰莖組織內(nèi)nNOS的表達量，發(fā)現(xiàn)老年大鼠陰莖組織內(nèi)nNOS的表達明顯降低。nNOS表達降低可直接導致神經(jīng)源性NO合成減少，使陰莖不能迅速達到勃起狀態(tài)。Dashwood等〔14〕通過免疫組化等方法證實在人類陰莖海綿體中nNOS表達下降可導致ED的發(fā)生，這與本研究的理論相符。

另外，Galiano等〔7〕認為陰莖海綿體組織中的內(nèi)皮細胞生成NO減少是ED發(fā)生的主要原因，而本研究發(fā)現(xiàn)海綿體內(nèi)皮細胞電鏡下細胞器減少，線粒體聚集空泡化，細胞核異常等變化可能是ED的形態(tài)學病因。因此，本研究認為DDAH1和nNOS表達減少可能是老年性ED發(fā)病的主要原因之一。

4參考文獻

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〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：傅強(1968-)，男，博士，碩士生導師，主任醫(yī)師，主要從事勃起功能障礙相關(guān)研究。

基金項目：山東省科技攻關(guān)計劃(2007GG2N02074)

〔中圖分類號〕R698+.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0553-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.016