條件性味覺厭惡學習對大鼠舌乳頭上皮leptin的表達及上皮細胞超微結構的影響

李海艷　李寶群　耿丹丹　程振宇

(承德醫學院人體解剖教研室，河北　承德　067000)

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條件性味覺厭惡學習對大鼠舌乳頭上皮leptin的表達及上皮細胞超微結構的影響

李海艷李寶群耿丹丹1程振宇

(承德醫學院人體解剖教研室，河北承德067000)

〔摘要〕目的制備條件性味覺厭惡學習大鼠模型，觀察味覺厭惡學習(CTA)對舌乳頭上皮瘦素(leptin)表達的影響和超微結構變化的影響。方法SD大鼠麻醉后，固定于腦立體定位儀上，于頂部切開皮膚，深達頂骨。經皮膚切口處經耳、眼間皮下組織導入聚乙烯管經頰部穿入口腔，在頂骨表面打孔、上螺絲釘，用以固定導管，將味溶液經導管注入口腔。術后3~5 d，經導管向口腔內注入0.2 mol/L蔗糖溶液5 ml，再腹腔注0.15 mol/L LiCl，建立味覺厭惡學習模型。灌流固定后取舌，采用免疫組化技術和電鏡方法來觀察舌乳頭上皮的情況。結果①leptin的陽性表達出現在舌乳頭上皮內，且CTA組舌乳頭上皮的表達明顯高于對照組。②實驗組線粒體數目明顯減少，并出現水腫，嵴斷裂；細胞核不規則，核膜凹陷或形成核袋；細胞鑲嵌連接的縫隙變小；可見溶酶體。結論建立CTA動物模型后，表現為對甜味的明顯厭惡，CTA可影響leptin在舌乳頭上皮中的表達。而且一些細胞器形態異常，可能是動物自身的一種應激反應或保護機制。

〔關鍵詞〕味覺厭惡學習；瘦素；舌乳頭上皮

1河北醫科大學人體解剖教研室

第一作者：李海艷(1979-)，女，講師，碩士，主要從事動物形態與生理研究。

動物攝取某種新異的味覺刺激后，若出現惡心、嘔吐、腹瀉等內臟不適，動物便可“記住”這種食物的味覺特征，減少或拒絕攝取具有相同味覺特征的食物，這種行為變化過程稱為條件性味覺厭惡學習(CTA)，是動物避免重復攝取有毒食物的一種重要學習機制。味覺對于調節攝食，控制體重起著重要的作用。其中由脂肪細胞產生的瘦素(leptin)能夠調整食物的吸收，能量的消耗和體重。目前認為味覺器官是leptin作用于外周的靶器官之一，leptin抑制對甜味物質的行為是通過作用于味覺細胞的ob-Rb受體，降低味覺感受器的敏感性。因此由leptin引起的味覺調整可能參與對食物吸收的調整〔1〕。本研究通過建立大鼠CTA模型，探討大鼠的學習記憶活動與leptin蛋白的關系。

1材料與方法

1.1動物及主要試劑成年雄性清潔級SD大鼠28只，體重250～300 g，購于河北醫科大學實驗動物中心〔許可證號：SCXK(冀)2008-1-003〕。購入后分籠飼養5～7 d，自由攝食和飲水，每日予以撫摩。隨機分為兩組：CTA組和對照組，每組14只。其中每組用來做免疫組織化學檢測10只，做電鏡檢測4只。leptin兔多克隆抗體干粉(PR-0205，北京中杉金橋生物技術有限公司)，用前PBS溶解，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，二氨基聯苯胺(DAB，Sigma公司)，戊巴比妥鈉，LiCl，水合氯醛等。

1.2口腔插管手術大鼠適應飼養后，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(45 mg/kg體重)麻醉，固定于腦立體定位儀上，手術暴露頂骨。將醫用單孔聚乙烯管的一端，由皮膚切口處經耳眼間皮下組織導入大鼠頰部并穿入口腔，在口腔內加一墊圈固定，在頂骨表面固定兩螺絲釘，將導管上端用牙托粉固定于螺絲釘上，傷口處灑上滅菌結晶磺胺消炎。

1.3CTA模型的建立口腔插管手術后3~5 d，經口腔插管向口腔內注入0.2 mol/L蔗糖溶液5 ml，5 min內注完。20 min后，腹腔注0.15 mol/L的LiCl (20 ml/kg體重)，禁食禁水12 h后，用兩瓶法測定水和蔗糖的攝取量。如果對蔗糖的攝取量<0.5 ml，則說明建立了1次CTA。重復建立3次予以鞏固。

1.4免疫組織化學顯色造模成功后，腹腔內注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)麻醉，打開胸腔暴露心臟，經升主動脈插管，150 ml生理鹽水灌流沖洗，麻醉后用4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 mol/L PB，pH7.4)，灌流固定1.5 h，取舌，一部分置于4%多聚甲醛固定用于光鏡觀察，另一部分用戊二醛固定用于電鏡觀察。用于光鏡觀察的經常規石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm，每隔3片取1片。采用SP免疫組織化學顯示法測定大鼠舌的leptin表達水平。leptin兔多克隆抗體稀釋濃度為1∶300，DAB染色，蘇木素復染。陰性對照以PBS代替一抗進行免疫組織化學染色，其他步驟相同。在光學顯微鏡下觀察免疫陽性產物的分布，應用Nikon顯微鏡Image-Pro Plus(IPP)分析軟件測量陽性產物的厚度。每只大鼠觀察6張切片，每張切片在200倍顯微鏡下取6個視野，單位面積內leptin陽性細胞數(個/mm2)，取平均值作為該舌乳頭上皮leptin蛋白表達的相對水平。

1.5電鏡觀察切取兩組舌，切成約1 mm3的小塊，快速放入3.1%戊二醛固定2 h，1%OSO4后固定1 h，丙酮梯度脫水，常規電鏡包埋，半薄切片，光鏡下選區、定位，超薄切片，鈾-鉛雙染。透射電鏡下觀察上皮細胞的超微結構并照相。

1.6統計學方法采用SPSS14.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1leptin陽性表達比較leptin陽性產為位于細胞質，呈棕黃色，廣泛分布在絲狀乳頭、菌狀乳頭以及輪廓乳頭上皮。CTA組與舌乳頭的上皮染色明顯加深；對照組絲狀乳頭和菌狀乳頭陽性上皮leptin的表達均比CTA組明顯降低(P<0.01)(圖1)。

2.2舌上皮細胞的超微結構改變對照組相鄰上皮細胞側面，質膜相互凹凸相嵌，形成鑲嵌連接。細胞核大，較規則，有明顯的核仁，異染色質少，常染色質豐富。粗面內質網少，核糖體豐富，可見橋粒。核膜清晰，可見雙層，異染色質多，相鄰細胞膜形成鑲嵌連接。線粒體量較多，嵴清晰。粗面內質網較少，核糖體豐富，見圖2。CTA組舌上皮細胞之間的鑲嵌連接的縫隙明顯變小，橋粒較豐富，多數細胞核較規則，可見核仁。細胞核可見核袋，異染色質較少，常染色質豐富。有的染色體腫脹、嵴斷裂，有的染色體致密、嵴模糊。粗面內質網少見，核糖體豐富，可見溶酶體。細胞核不規則，核膜凹陷或形成核袋。異染色質較多，邊集在核膜表面。線粒體水腫，部分嵴斷裂或形成絮狀結構。核糖體豐富，粗面內質網少見，見圖3。

對照組絲狀乳頭

CTA組絲狀乳頭

對照組菌狀乳頭

CTA組菌狀乳頭

圖2　對照組舌上皮細胞的超微結構

圖3　CTA組舌上皮細胞的超微結構

3討論

leptin主要在脂肪組織中表達，它被認為是一種飽食信號，主要是調節能量平衡和控制體重。給遺傳性肥胖小鼠(ob小鼠)的腦脊液注入瘦素后，進食量明顯減少，體質量也逐漸下降到正常水平〔2〕。Monteleone等〔3〕和Waelput等〔4〕發現leptin具有廣泛的生物學效應：一是通過與下丘腦的瘦素受體結合，它主要是抑制下丘腦弓狀核的表達和分泌神經肽Y等多種神經內分泌激素的分泌，從而降低食欲，減少食物的攝入和減輕體重；二是作用于其他外周組織(包括肝臟、脾、肺、腎、心、胰腺)的瘦素受體，其中腦內表達較高〔5〕。動物建立味覺厭惡學習后，有惡心、嘔吐、腹瀉等內臟不適的表現，對攝食的適應性調節能力降低，進而導致胃排空的延遲。而leptin水平及其受體表達的多少和性狀的改變，可以改變胃的順應性，抑制攝食，延遲胃排空。原因是leptin直接激活迷走神經傳入神經元，通過迷走神經到達孤束核(NTS)刺激leptin敏感神經元，再抑制胃運動和排空〔6〕。敲除leptin受體基因的db/db小鼠，依然能建立條件性味覺厭惡學習，但是卻加快了CTA的消退過程。這種現象的出現可能是因為leptin受體廣泛分布在CTA相關的腦區〔7〕。此外在CTA形成和保持中，leptin受體的活性或功能發生變化，表明leptin在味覺和內臟信息的相互作用中具有重要的作用〔8〕。但是動物建立CTA后是否會影響leptin的表達，目前尚未見到報道。

同時也有人通過半定量RT-PCR分析顯示ob-Rb受體在菌狀乳頭和輪廓乳頭的味蕾中有表達，但在周圍的上皮組織中表達的不是很清楚。在這3種不同組織中的表達，部分與味覺特異性G蛋白、alpha-gustducion很相似。其他的Ob-R在其他的味覺乳頭或者上皮組織都有廣泛的分布〔9，10〕。本研究結果提示瘦素在味覺厭惡學習中發揮一定的作用，可能參與了大鼠的學習記憶活動，充實了CTA理論。

目前有關建立CTA后對細胞器的影響報道較少。線粒體是真核生物能量和代謝的中心。目前已認識到線粒體是細胞凋亡的“中心執行者。本實驗提示細胞之間的通透性變差，以減少對甜味物質的吸收，CTA組可見溶酶體，可能是大鼠建立CTA后，舌上皮出現水腫，細胞有壞死的情況。總之，通過實驗可以看出，動物建立CTA這一涉及厭惡情緒的模型后，導致了一些細胞器形態結構異常，可能是動物自身的一種應激反應或保護機制，探究其原因，還需要進一步的研究。

4參考文獻

1Shigemura N，Ohta R，Kusakabe Y，etal.Leptin modulates behavioral responses to sweet substances by influencing peripheral taste structures〔J〕.Endocrinology，2004；145：839-47.

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3Monteleone P，Maj M, Dilieto A，etal. Leptin functioning in eating disorders〔J〕. CNS Spectrums, 2004；9(7)：523-9.

4Waelput W，Brouckaert P，Broekaert D，etal. A role for leptin in the systemic inflammatory response syndrome(SIRS) and in immune response 〔J〕. Inflamm Allergy，2002；1(3)：277-89.

5王麗紅，陳諾琦. 瘦素的生物學效應及與糖尿病的聯系〔J〕. 中國實用醫藥，2010；5(19)：239-41.

6于衛星，魏良洲. 瘦素與胃排空〔J〕. 國際消化病雜志，2007；27(6)：428-30.

7Ohta R，Shigemura N. Conditioned taste acersion learning in leptin-receptor-deficient db/db mice〔J〕. Neurobiol Lear Mem，2003；80(2)：105-12.

8韓蓁，閆劍群，宋新愛，等. 瘦素受體在條件性厭味大鼠腦的表達〔J〕. 第四軍醫大學學報，2003；24(1)：11-3.

9李海艷，陳萌，孫祥玉.瘦素及其受體與消化系統關系的研究進展〔J〕.承德醫學院學報，2012；29(2)：187-9.

10唐美岸，何振華，張秀蜂. 苦參堿對肺纖維化大鼠肺線粒體氧化應激的影響〔J〕. 廣東醫學，2012；33(2)：182-5.

〔2014-08-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R338

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0564-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.021