老年非小細胞肺癌中Raf激酶抑制蛋白與p-AKT的表達及意義

楊大運　邢亞威　張月花　齊　戰

(河北醫科大學第四醫院內科，河北　石家莊　050011)

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老年非小細胞肺癌中Raf激酶抑制蛋白與p-AKT的表達及意義

楊大運邢亞威張月花齊戰1

(河北醫科大學第四醫院內科，河北石家莊050011)

〔摘要〕目的探討Raf激酶抑制蛋白(RKIP)及p-AKT在老年非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及意義。方法對RKIP和p-AKT的蛋白進行間接免疫熒光標記，采用流式細胞儀對78例NSCLC及相應癌旁正常肺組織進行定量檢測。結果RKIP在 NSCLC組織中的表達量明顯低于癌旁正常肺組織(P<0.05)；p-AKT在NSCLC組織中的表達量明顯高于癌旁正常肺組織(P<0.05)；RKIP、p-AKT的表達量均與肺癌分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及術后生存期有關(P<0.05)。結論在肺癌發生中RKIP表達減少，p-AKT表達上調，可能是導致NSCLC發生、發展的原因，可作為NSCLC惡性程度及預后判斷的指標。

〔關鍵詞〕非小細胞肺癌；流式細胞術；Raf激酶抑制蛋白；p-AKT

1河北醫科大學第四醫院胸外科

第一作者：楊大運(1973-)，女，副主任醫師，博士，主要從事肺癌的侵襲轉移研究。

以非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數的80%，腫瘤的復發、轉移是NSCLC患者死亡的主要原因。 Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族成員，是近年來新發現的一種腫瘤轉移抑制因子，具有抗腫瘤侵襲轉移的作用〔1〕。AKT是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是原癌基因之一〔2〕。磷酸化的AKT(p-AKT)是其活化形式，它參與多種腫瘤的形成。本研究應用流式細胞術檢測RKIP和p-AKT在NSCLC及正常肺組織中的表達情況，探討兩者與NSCLC患者臨床病理特征的關系。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2011年1~12月我院病理科確診為NSCLC的手術標本78例，對照組為相應癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)。年齡60~75歲，平均年齡65.5歲；其中男46例，女32例；吸煙者44例，非吸煙者34例；鱗癌43例，腺癌35例；肺癌分期采用2009年IASLC/UICC公布的第7版TNM分期標準，Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲa+Ⅲb期30例；有淋巴結轉移者38例，無淋巴結轉移者40例。所有標本均由病理學教授進行HE染色切片，明確病理診斷。患者術前均未行放療或化療。兔抗人RKIP多抗、兔抗人p-AKT多抗均為美國Santa Cruz公司產品。 FITC標記的羊抗兔IgG二抗為武漢博士德生物工程有限公司產品。

1.2流式細胞檢測(FCM)

1.2.1樣品的制備切取組織塊，網搓法制備細胞濃度為1×106/ml的單細胞懸液。

1.2.2間接免疫熒光法標記取0.1 ml單細胞懸液，分別加入1∶100稀釋的RKIP兔抗人多克隆抗體和兔抗人p-AKT多克隆抗體工作液各0.1 ml。室溫孵育30 min，加入PBS洗滌后，棄上清，加入1∶50稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG二抗工作液0.1 ml。避光室溫孵育30 min，PBS洗滌，離心，棄上清除去未結合的熒光抗體，將細胞重新懸浮于1 ml PBS中，過濾后流式細胞儀檢測。每次檢測除以同一患者正常肺組織作為正常對照外，還設有PBS代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加一抗或二抗的陽性對照和同型對照。

1.2.3流式資料分析方法按Morkve等〔3〕提出的分析方法，以熒光指數(FI)表示它們的相對含量，公式為：FI=(樣品基因蛋白表達的平均熒光強度-陰性對照的平均熒光強度)/陰性對照的平均熒光強度。FI>1.0為RKIP或p-AKT陽性表達，FI≤1.0為陰性表達。

1.3統計學分析應用SAS13.00軟件行t檢驗和One-Way ANOVA。

2結果

2.1RKIP、p-AKT在NSCLC與正常肺組織中的表達在NSCLC與正常肺組織中，RKIP的表達量分別為1.563±0.132和1.114±0.107，二者差異顯著(t=18.380，P<0.05)；p-AKT的表達量分別為1.113± 0.125和1.529±0.124，二者差異顯著(t=19.260，P<0.05) 。

2.2RKIP、p-AKT的表達與NSCLC臨床病理特征的關系RKIP、p-AKT均與NSCLC的臨床分期、腫瘤的分化程度、生存期及淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與性別、吸煙史、腫瘤大小以及病理類型無關(P>0.05)。見表1。

表1　肺癌組織中RKIP的表達與NSCLC臨床病理特征的關系±s)

3討論

RKIP是一種高度保守、廣泛表達的小分子胞質蛋白，參與細胞凋亡、神經發育以及精子發生等病理生理過程。目前研究發現，RKIP具有抑制腫瘤轉移的功能，是一種腫瘤轉移抑制基因，它參與細胞內ERK/MAPK、NF-κB等信號通路的調控〔4〕，通過上調E-cadherin和下調MMPs的表達，抑制上皮-間葉轉變，降低對細胞外基質和基底膜的破壞，進而發揮其抗侵襲、轉移的功能〔5,6〕。多項研究顯示，RKIP在結直腸癌〔7〕、胃癌〔8〕、肝癌〔9〕等多種腫瘤組織中表達下調，本結果顯示，NSCLC中RKIP的表達量明顯低于正常肺組織，其表達量與肺癌的分化程度、TNM分期、有無淋巴結轉移以及生存時間有關。表明RKIP表達量減少在NSCLC的發生及侵襲轉移過程中發揮重要作用。

研究發現，p-AKT在鱗狀上皮化生和不典型增生組織中高度活化，遠高于肺癌組織，正常的支氣管上皮組織中表達較少或缺失，說明p-AKT參與了癌變的早期階段〔10〕。研究發現，p-AKT在多種腫瘤組織中過度表達〔11~14〕。關于p-AKT的表達對于NSCLC侵襲轉移及預后的意義，仍然存在著爭議，更多的研究傾向于p-AKT過度活化預示NSCLC預后較差。本實驗結果顯示，NSCLC中p-AKT的表達量明顯高于正常肺組織，其表達量與肺癌的分化程度、TNM分期、有無淋巴結轉移以及生存時間有關，表明原癌基因AKT參與了NSCLC的發生發展，p-AKT表達量增加在NSCLC的發生及侵襲轉移過程中發揮重要的作用。

4參考文獻

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〔2014-08-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：齊戰(1971-)，男，主任醫師，博士，主要從事肺癌以及食管癌的侵襲轉移研究。

〔中圖分類號〕R734.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0644-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.058