鮑曼不動桿菌耐藥性與噬菌體的相關性

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鮑曼不動桿菌耐藥性與噬菌體的相關性

周園王嵐林鴻馮偉1劉新

(遼寧省環境污染與微生態實驗室，遼寧沈陽110034)

〔關鍵詞〕噬菌體；鮑曼不動桿菌；耐藥性

1沈陽市第四人民醫院重癥醫學科

第一作者：周園(1967-)，女，高級講師，碩士，主要從事微生態學及微生物學研究。

關于Ab形態結構與耐藥性關系鮮有報告，噬菌體是感染細菌的病毒，具有溶原性和裂解性兩種生長方式〔1〕，根據與宿主菌的相互關系，分為溫和噬菌體、毒性噬菌體兩種類型。過去人們關注毒性噬菌體裂解宿主菌，期待發揮治療性應用，但長期研究并未取得實質性進展〔2〕。鮑曼不動桿菌(Ab)為非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛分布于外環境中，它黏附力極強，是引起醫院內感染的重要條件致病菌之一，在住院病人尤其是重癥監護病房(ICU)的老年患者中可引起致命性感染。關于Ab形態結構與耐藥性關系鮮有報告。本研究對ICU 60歲及以上感染患者分離的Ab菌株進行耐藥性分析及細菌超微結構觀察，探討耐藥菌引起醫院感染的機制。

1材料和方法

1.1標本采集標本來自沈陽市第四人民醫院ICU病房，包括患者痰、呼吸機導管及手術的引流管等，臨檢判定為Ab，經LB肉湯培養基增菌，然后轉種于青霉素·諾氟沙星培養基上培養。單個菌落經中國藍培養基，44℃連續傳代純化，生化反應測定符合不動桿菌屬，細菌鑒定儀鑒定到種。將經過鑒定的菌株通過肉湯培養基增菌24 h，比濁法調細菌的密度為1×108/ml，備用。

1.2試劑與儀器營養瓊脂培養基，中國藍培養基，M-H培養基(北京奧博星生物技術有限公司)，革蘭陰性桿菌鑒定試劑條(REF 32100 梅里埃公司)，藥敏紙片(OXOID 公司)： 哌拉西林(PIP)、 頭孢曲松(CRO)、 頭孢他啶(CAZ)、 頭孢噻肟(CTX)、 頭孢吡肟(FEP)、 亞胺培南(IPM )、美洛培南(MEM)、 氨曲南(AZT)、 頭孢哌酮舒巴坦(CSL)、 替卡西林 /克拉維酸(TCC)、 哌拉西林/他唑巴坦(TZP)。質控菌株為大腸桿菌ATCC25922、 銅綠假單胞菌ATCC27853，Ab標準株：ATCC 19606(寶特生物公司代購)，本室保存傳代。自動化細菌鑒定儀(ATB，法國生物梅里埃公司)，S-4800冷場發射掃描電鏡(日立公司北京辦事處)。

1.3菌種鑒定標本直接涂片，革蘭染色；氧化酶、觸酶、硝酸鹽還原試驗及動力試驗。ATB鑒定，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4藥敏試驗采用K-B 紙片擴散法,判定標準按照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2012版執行〔3〕。

1.5掃描電鏡標本制備將具有泛耐藥的菌株以1 200 r/min,離心2 min，得到細菌集團，取少量轉入盛有預冷的2.5 %戊二醛固定劑eppendorf管中固定，4℃過夜。4℃條件下0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗 15 min ×3次，1%鋨酸固定液固定2 h，0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min ×3次，脫水：50%乙醇15~20 min ，70%乙醇15~20 min ，90%乙醇15~20 min，90%乙醇90%丙酮(1∶1)15~20 min，90%丙酮15~20 min。固化：37℃過夜。鍍膜20S。S-4800冷場發射掃描電鏡觀察。

2結果

2.1藥敏試驗見表1。Ab為革蘭陰性球桿菌，多成對排列；無芽胞、無鞭毛，較難脫色，氧化酶、硝酸鹽還原動力試驗陰性。

表1　45株Ab對抗生素的藥敏試驗〔n(%)〕

2.2耐藥Ab超微結構觀察經呼吸機導管分離的耐藥Ab表面可見數個噬菌體附著，噬菌體頭部呈多邊形，噬菌體頭部直徑小于200 nm，菌體形態保持球桿狀；菌體球桿狀，表面光滑，無細胞壁破裂；菌毛附著于菌體：短而直、中空管狀,末端有多處分枝；菌體間可見分枝的菌毛呈多向接合。未見尾絲結構，菌體完整無破損，非耐藥Ab對照株菌體表面光滑，未見噬菌體吸附；耐藥株菌體尚可見中空管狀的性菌毛及多向接合(圖1)。

圖1　Ab掃描電鏡圖片

3討論

目前報告Ab的耐藥機制比較復雜，包括耐藥酶或稱藥物滅活酶的產生；外膜蛋白的減少、缺失或突變；藥物外排泵的形成；藥物作用靶位：青霉素結合蛋白(PBPs)表達減低或缺乏及可移動遺傳元件參與的耐藥基因的傳遞等。噬菌體在自然界廣泛分布，凡是有細菌的場所，就有相應噬菌體的存在。噬菌體的形態結構一般分成三種類型：即無尾部結構的二十面體，有尾部結構的二十面體和線狀體〔4〕。本試驗中觀察到Ab耐藥株的噬菌體為多邊形，未見尾絲結構，故應屬無尾部結構的二十面體噬菌體，本室保存的Ab標準菌株ATCC19606，為細菌生物被膜模式株〔5〕，未見噬菌體存在，藥敏試驗表明對多種抗生素敏感，提示耐藥菌株上的溫和噬菌體可能與其耐藥有關。

溫和噬菌體是指噬菌體感染細菌后，并不裂解宿主菌引起死亡，關于溫和噬菌體與不動桿菌溶原性及與耐藥相關性目前未見有報道。本研究說明宿主菌處于溶原狀態，如果噬菌體將其自身的基因組整合于宿主菌中的染色體中，這種整合意味著宿主菌基因組變化，是否因此導致耐藥性有待于進一步研究。

另外，本研究在電鏡下還觀察到Ab存在性菌毛多重接合現象，值得加以關注。呈分枝狀的性菌毛，使接合的機會更多，這種現象未見有文獻報道。因為性菌毛能在細菌之間傳遞DNA，是細菌產生耐藥性的原因之一，本研究結果提示溶原性細菌可能通過噬菌體啟動耐藥基因，而由性菌毛多重接合，將耐藥基因廣泛傳遞使細菌快速產生了耐藥性，因此深入研究噬菌體在細菌耐藥性產生過程中的作用機制有望在預防和治療老年患者細菌感染方面提供新的思路。

4參考文獻

1李凡,涂志凱.醫學微生物學 〔M〕.第7版. 北京：人民衛生出版社，2008：43-5.

2梁莉，楊洪江，金鑫.鮑曼不動桿菌烈性噬菌體的分離與純化〔J〕.生物學雜志，2010;27(4)：88-90,93.

3孫長貴，成軍，楊燕.2012年CLSI M100-S22文件主要更新內容的解〔J〕.中華檢驗醫學雜志，2012;35(8)：676-8.

4聞玉梅.精編現代醫學微生物學〔M〕.上海： 復旦大學出版社，2002：61-2.

5Gaddy JA，Tomaras AP,Actis LA. The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA protein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and in the interaction of this pathogen with eukaryotic cells〔J〕.Infect Immu,2009;77(8):3150-60.

〔2014-06-09修回〕

(編輯張慧)

通訊作者：劉新(1961-)，女，教授，碩士，碩士生導師，主要從事醫院感染研究。

基金項目：沈陽醫學院科學研究基金項目(20111029)

〔中圖分類號〕Q939.48

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0709-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.088

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