意大利生菜組織培養體系的建立

鄧 瑩，羅 雯

(南昌師范學院生物系，江西南昌 330032)

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意大利生菜組織培養體系的建立

鄧 瑩，羅 雯*

(南昌師范學院生物系，江西南昌 330032)

摘要[目的]建立意大利生菜組織培養體系。[方法]以意大利生菜(LactucasativaL. var.ramosaHort.)種子為試驗材料，用不同有效氯含量(0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)的漂白水滅菌，于MS培養基上培養無菌苗。取4~5 d苗齡的無菌幼苗子葉，在添加不同濃度激素的MS培養基上誘導愈傷組織，并進一步誘導生芽、生根，篩選最佳誘導激素配比及激素濃度。[結果]意大利生菜種子經有效氯含量1.0%的漂白水處理，于MS培養基上培養可獲得意大利生菜無菌苗。無菌幼苗子葉在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養基上，可以得到理想的意大利生菜愈傷組織；在MS+0.25 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養基上，最有利于意大利生菜愈傷組織不定芽的發生且對后期生根有良好的誘導作用。[結論]配合使用一定濃度的6-BA和NAA可有效建立意大利生菜組織培養再生體系，為進一步建立意大利生菜遺傳轉化體系奠定基礎。

關鍵詞意大利生菜；子葉；組織培養

生菜屬于菊科Compostiae萵苣屬Lactuca,是一種含有多種營養元素，不經加工即可食用的蔬菜[1]。同時，生菜組培再生率和轉化率均較高，可以作為一種良好的植物生物反應器[2-3]。借助轉基因技術，能將生菜開發成一種有利的功能性蔬菜[4]。轉基因生菜最早于1987年獲得，而建立高效的生菜轉基因遺傳轉化體系的前提條件是建立生菜組織培養再生體系[5]。筆者以生長周期更短的意大利生菜(LactucasativaL.var.ramosaHort.)，為試驗材料，對其愈傷組織誘導和不定芽發生的最適激素配比進行了篩選，建立意大利生菜組織培養體系，為進一步建立意大利生菜遺傳轉化體系奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料意大利生菜種子廣西橫縣子龍種業有限公司。

1.2試劑藍月亮漂白水(有效氯含量4.0%)；植物生長調節激素6-BA、NAA(國藥集團化學試劑有限公司產品)；MS培養基。

1.3方法

1.3.1無菌苗培養條件的篩選。將適量的意大利生菜種子用75%乙醇消毒30 s，無菌蒸餾水沖洗2次，每次3 min。將種子分別放入不同濃度的漂白水(有效氯含量分別為0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)消毒15 min，再用無菌蒸餾水沖洗3次，每次3~4 min，瀝干水分后點種于MS培養基上，于光照培養室中培養，溫度(25±1)℃，光照強度2 000 lx，光照周期16 h/d，5 d后觀察種子萌發情況。

1.3.2愈傷組織誘導條件的篩選。愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基，添加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂及不同濃度配比的6-BA和NAA，pH 5.8，121 ℃滅菌30 min。6-BA濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，NAA濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L。取苗齡5 d的生菜無菌苗，沿分生點處切取生菜的兩片子葉，分別接種于附加不同濃度激素的愈傷組織誘導培養基上，葉片正面朝上，保證切口與培養基充分接觸，于光照培養室中培養，溫度(25±1)℃，光照強度2 000 lx，光照周期16 h/d，14 d后記錄愈傷組織形成情況并統計其誘導率。

1.3.3愈傷組織分化產生不定芽的誘導條件篩選。挑選健康的愈傷組織從外植體上切下，轉移至不定芽誘導培養基上。誘導培養基為MS基本培養基，添加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂及不同濃度配比的6-BA和NAA，pH 5.8，121 ℃滅菌30 min。6-BA濃度分別為0.15、0.25、0.35、0.45 mg/L，NAA濃度分別為0.10、0.15、0.20 mg/L。不定芽誘導在光照培養室中進行，溫度(25±1)℃，光照強度2 000 lx，光照周期16 h/d，14 d后統計不定芽數目和誘導率。

1.3.4再生苗生根培養。將長勢良好的再生芽接種于MS基本培養基上，于光照培養室中培養，溫度(25±1)℃，光照強度2 000 lx，光照周期16 h/d。6~12 d后觀察意大利生菜再生苗生根情況。

2結果與分析

2.1無菌苗培養條件由表1可知，意大利生菜種子萌發率隨著漂白水有效氯含量的升高先升高后降低。當有效氯含量低于1.0%時，由于消毒不徹底，雜菌的污染也會抑制種子的萌發。當有效氯含量高于1.0%時，有效氯含量越高對種子萌發的抑制作用越明顯。因此，使用有效氯含量為1.0%的漂白水處理種子，消毒效果良好且無雜菌生長，種子的萌發率最高(達10.7%)。

表1培養5 d后意大利生菜無菌苗生長情況

Table 1The growth of lettuce aseptic seedlings after 5 days of culture

漂白水(有效含氯量)Bleach(availablechlorine)∥%萌發率Seedlingrate∥%無菌苗Asepticseedlinggrowth雜菌Mixedbacteriagrowth012.8++++0.548.7+++1.070.7+++-2.060.7+-4.051.3+-

注 ：-無生長；+生長數量較少； ++生長數量中等 ；+++生長數量較多。

Note: -，+，++，+++ stand for no growth，small growth quantity，medium growth quantity and more growth quantity，respectively.

2.2愈傷組織誘導條件由表2可知，當6-BA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.20 mg/L時，愈傷組織出愈率達100.0%，愈傷組織高等發生，無褐化和玻璃化現象，是愈傷組織誘導的最適培養基。部分愈傷組織誘導結果見圖1。

2.3愈傷組織分化產生不定芽的培養條件由表3可知，在所選濃度范圍內，當6-BA和NAA濃度較低時，對不定芽的發生影響不大，發生頻率均較低；而含有0.25 mg/L 6-BA和0.20 mg/L NAA的培養基，以及含有0.35 mg/L 6-BA和0.15 mg/L NAA的培養基對不定芽的誘導作用均較強，不定芽的發生頻率高，生長迅速，無玻璃化發生，是不定芽分化誘導的最適培養基。部分不定芽分化誘導結果見圖2。

表2不同濃度6-BA和NAA配比對意大利生菜愈傷組織誘導的影響

Table 2Effects of different concentrations of 6-BA and NAA ratio on lettuce callus

培養基編號SerialNo.6-BAmg/LNAAmg/L出愈率Recoveryrate∥%愈傷組織Callus褐化Browning玻璃化Vitrification10.10.0580.0++-20.10.1081.8+++++30.10.1583.3+++++40.10.2077.8++-50.20.0541.7++-60.20.1027.3++++++70.20.15100.0++--80.20.2053.8+++-90.30.05100.0+++-100.30.1063.6++--110.30.1541.7++++120.30.2054.5+++-130.40.05100.0++++-140.40.1091.7+++--150.40.1533.3++++160.40.2027.2++++++170.50.0550.0+++++180.50.1050.0++-190.50.1550.0+-+200.50.20100.0+++--

注：-不發生；+低等發生；++中等發生；+++高等發生。

Note：-，+，++ and +++ stand for no occurrence，low occurrence，medium occurrence and higher occurrence，respectively.

2.4再生苗生根培養條件在MS基本培養基上培養6~12 d后，生根較早、生根數量較多的是添加0.25 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA培養基的誘導芽，其次是添加0.35 mg/L 6-BA和0.15 mg/L NAA培養基的誘導芽。說明前期芽的誘導培養基激素濃度對后期生根有一定影響。

圖1　愈傷組織誘導結果Fig.1　The induction results of callus

培養基編號SerialNo.6-BAmg/LNAAmg/L不定芽Sprouting玻璃化Vitrification培養基編號SerialNo.6-BAmg/LNAAmg/L不定芽Sprouting玻璃化Vitrification10.150.10+-70.350.10+-20.150.15+-80.350.15+++-30.150.20+-90.350.20++40.250.10++-100.450.10+-50.250.15++110.450.15++-60.250.20+++-120.450.20+-

注：-不發生；+低等發生；++中等發生；+++高等發生。

Note：-，+，++ and +++ stand for no occurrence，low occurrence，medium occurrence and higher occurrence，respectively.

圖2　不定芽誘導結果Fig.2　The induction results of adventitious buds

3結論與討論

在植物基因轉化方式中，以農桿菌介導的細胞核基因轉化技術最為成熟。生菜屬于菊科植物，是農桿菌的天然宿主。研究者對多種基因型生菜進行了誘導、分化及成苗最適條件研究。以散葉生菜大速生(LactucasativavarcapatataL.)子葉為試材，不同研究者獲得的最適誘導激素濃度不同，趙吉強等[2]在附加0.10 mg/L 6-BA及0.05 mg/L NAA的MS培養基上獲得了最佳誘導生芽效果；而其他研究者則分別在附加1.5 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IAA或0.5 mg/L 6-BA及0.5 mg/L IAA的MS培養基上獲得了最佳誘導生芽效果[1，3]。可見，在不同試驗條件下，即便是同種基因型的生菜分化誘導的最適激素濃度也會有明顯差異。與其他基因型生菜相比，意大利生菜具有生長周期短，一年可收獲四季的優點。該研究以意大利生菜為試材，研究了愈傷組織誘導和不定芽發生的最佳條件，建立了意大利生菜組織培養再生體系，與其他研究獲得的最佳誘導條件顯著不同[5]。該研究表明，意大利生菜愈傷組織誘導激素條件為0.5 mg/L 6-BA及0.20 mg/L NAA；不定芽誘導激素條件為0.25 mg/L 6-BA和0.20 mg/L NAA。在此基礎上，可進一步研究農桿菌介導葉盤法轉化意大利生菜的最佳條件，為構建功能性生菜提供可行途徑。

參考文獻

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[3] 鄧小莉，周巖，常景玲．生菜遺傳轉化體系的建立及轉基因研究[J].云南植物研究， 2007，29(1)：98-102.

[4] 劉思言，姚丹，關淑艷，等.生菜遺傳轉化受體體系的建立[J].吉林蔬菜，2011(6)：98-99.

Establishment of Tissue Culture System ofLactucasativaL. var.ramosaHort.

DENG Ying，LUO Wen*(Biology Department，Nanchang Normal University，Nanchang，Jiangxi 330032)

Abstract[Objective] To establish the tissue culture system forLactucasativaL. var.ramosaHort. [Method]LactucasativaL. var.ramosaHort. seeds were disposed with different concentration javelle (0，0.5%,1.0%，2.0%,4.0%)for sterilization,and aseptic seedlings were cultured on MS medium. Taking cotyledons from the 4-5 days of seedlings as explants，the ideal sorts and concentrations of plant hormones were tested for induction of calluses，buds and roots seperately. [Result]LactucasativaL. var.ramosaHort. seeds were disposed with 1.0% available chlorine javelle and aseptic seedlings were gotten on MS culture medium. Taking cotyledons from the 4-5 days of seedlings as explants，the ideal calluses were induced and generated on the medium of MS medium supplied with 0.5 mg/L 6-BA，0.20 mg/L NAA，30 g/L sucrose and 7 g/L agar. The most in favor medium for bud differentiation from calluses were MS medium supplied with 0.25 mg/L 6-BA，0.20 mg/L NAA,30 g/L sucrose and 7 g/L agar，which was also beneficial for rooting subsequently. [Conclusion] The appropriate concentration of 6-BA and NAA was effective forLactucasativatissue culture,and lay a foundation for establishing geetic transformation system ofLactucaSativeL. var.ramosaHort.

Key wordsLactucasativaL. var.ramosaHort.; Cotyledon; Tissue culture

收稿日期2015-12-18

作者簡介鄧瑩(1992- )，女，江西贛州人，本科生，專業：生物科學。*通訊作者，教授，博士，從事微生物學研究。

基金項目江西省自然科學基金項目(20151BAB205063)。

中圖分類號S 636.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-181-03