細菌性條斑病菌JH01誘導水稻抗病均一化差減文庫的構建

凌丹燕， 路 梅

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

?

細菌性條斑病菌JH01誘導水稻抗病均一化差減文庫的構建

凌丹燕， 路 梅*

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

摘要[目的] 構建細菌性條斑病菌誘導下的水稻抗病均一化差減cDNA文庫，對獲得的差異表達ESTs進行生物信息學及抗病相關基因的表達分析。 [方法]以水稻IR26(Tester)和兩優培九(Driver)幼苗5~6葉期葉片為材料，采用雙鏈特異性核酸酶(DSN)介導的均一化消減雜交技術，構建細菌性條斑病菌JH01誘導的水稻抗病相關基因差減cDNA文庫，以pLB-F和pLB-R為引物，通過菌液PCR擴增對差減文庫的質量進行檢測。[結果] cDNA文庫的插入片段分布在 0.5~2.0 kb，平均大小約為1.0 kb，重組率達 95%。序列測定分析發現，隨機挑取的504個克隆中有98 條差異表達基因；經 BLAST 比對和GO 注釋發現，59 條序列具有同源基因，分別參與信號轉導、能量代謝、過敏性壞死反應、防衛反應等；另外 39 條序列無相似基因，有待進一步研究。通過實時熒光定量PCR發現，從該文庫中分離得到的OsNDPK4參與細菌性條斑病菌JH01誘導的水稻防衛反應。[結論]水稻受細菌性條斑病菌侵染的 cDNA文庫質量較好，為研究條斑病菌致病性因子與水稻互作機制奠定基礎。

關鍵詞細菌性條斑病;水稻；雙鏈特異性核酸酶(DSN)；均一化差減雜交；熒光定量PCR

稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xooc)引起的水稻細菌性條斑病(Rice bacteria leaf streak，簡稱細條病或條斑病)是水稻上的重要細菌病害，具高度傳染性，一旦發病很難控制。1955年在廣東省首次發現該病，現已成為我國南方稻區的重要病害[1-2]。對于水稻細菌性條斑病的防治，目前以化學防治為主，然而農藥的大量使用不僅會造成環境污染，也會對人類健康產生危害。利用水稻自身的抗病相關基因培育抗病品種，則可以從根本上解決上述問題。而構建抗病差減全長cDNA文庫是目前尋找水稻抗細菌性條斑病基因的有效途徑之一[3]。

雙鏈特異性核酸酶(Duplex-specific nuclease)介導的均一化差減雜交是繼抑制性差減雜交(Suppression subtractive hybridizatiom,SSH)之后一種新的差異表達基因篩選技術[4]。該技術是基于雙鏈特異性的核酸酶分子豐度均等化策略和抑制性消減雜交的雜交方法而建立的[4-6]。該技術根據SMART原理和體外轉錄技術，分別獲取遺傳背景相似的2組試驗材料(Tester和Driver)的全長cDNA和RNA；將兩者充分雜交，雜交產物經過DSN 酶解；酶解產物經PCR擴增，差異表達片段(即沒有被酶解的單鏈cDNA)得到有效富集。此技術不僅可以篩選表達量很低的差異表達基因，而且可以獲得基因的全長cDNA，后續研究中無需進行基因的擴增等操作，彌補了SSH技術的缺點，是發現新基因、研究基因功能的重要手段[4，7]。筆者利用DSN介導的均一化差減雜交技術構建了細菌性條斑病菌誘導下的水稻抗病均一化差減cDNA文庫，對獲得的差異表達ESTs進行生物信息學分析及抗病相關基因的表達分析。

1材料與方法

1.1水稻品種和病原菌株水稻兩優培九和IR26由浙江省金華市植物保護站惠贈，黃單胞菌稻生致病變種JH01為浙江師范大學分子生物學實驗室保存。水稻采用國際IRRI水稻培養液培養至幼苗5~6葉期；菌株JH01于NA固體培養基和液體培養基28 ℃培養。

1.2引物及其序列消減雜交中所用引物及其序列見表1。

1.3水稻接種病原菌后RNA的提取用NB 液體培養基將JH01菌液稀釋至約3×108cfu/mL (OD600=0.6)，選擇水稻第3、4 片葉，用改良的針刺接種法接種[5]，每片水稻葉片沿主脈兩側對稱接種10個孔，每個水稻品種接種300株；用NB 液體培養基作為陰性對照接種水稻葉片。接種后，28 ℃弱光照24 h條件下培養。接種后0、12、24、48、72、84、96 h剪下水稻葉片稱重，錫紙包裹并做好標記，經液氮速凍處理后儲存于-80 ℃超低溫冰箱。病原接種水稻IR26的樣品為處理組(Tester)，接種水稻兩優培九的樣品為對照組(Driver)。采用PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen)提取水稻葉片的總RNA。用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性檢測，樣品置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4文庫的建立

1.4.1全長cDNA合成。按照 SuperScript II(Invitrogen) 使用手冊合成cDNA第一條鏈。在 200 μL PCR管中加入對照組(Driver)/處理組(Tester)總RNA樣品 4.00 μL(1.5 μg)，然后依次加入0.50 μL TsOligo，0.50 μL Tspa，1.00 μL dNTPs(10 mmol/L)，2.00 μL 5×First-Strand Buffer(Invitrogen)，1.00 μL DTT，0.25 μL RNase inhibitor(40 U/μL)，0.75 μL SuperScript II RTase (200 U/μL) (Invitrogen)，共計10.00 μL體系。RT反應條件：42 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min。以此產物為模板，采用引物 SP6T7 和 3′AP 進行雙鏈全長cDNA合成反應，反應條件：94 ℃，2.0 min；X個循環(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 6 min)；X代表20、24、28、32個循環。PCR擴增體系后，采用PCR Cleanup Kit(Qiagen)進行純化回收。

表1　消減雜交中所用的引物

1.4.2體外轉錄和Tester逆轉錄。按照RiboMaxTM Large Scale RNA Production System-SP6(Promega )和ScriptMAXTM Thermo T7 Transcription Kit(Toyobo)操作手冊，分別將“1.4.1”純化的Tester和Driver雙鏈cDNA進行體外轉錄。加入DNase I消化模板基因組、RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)對消化產物進行純化。將純化后的Tester RNA利用引物 T7oligodT逆轉錄成 cDNA。

1.4.3雜交反應和DSN酶消化反應。將“1.4.2”中得到的tester cDNA與Driver RNA按照10.0 μL體系進行消減雜交：1.0 μL 10×Hybridization buffer，2.0 μL Tester cDNA(體外轉錄)；3.0 μL Driver RNA(15 μg)，加入DEPC-H2O補足至10.0 μL。反應條件：88 ℃充分變性2 min；55 ℃雜交16 h。

在新管中配制20.0 μL酶切體系[2.0 μL 10×DSN buffer，1.0 μL DSN(0.2 U/μl，Evrogen)，17.0 μL DEPC-H2O)]，預熱至65 ℃后加入上述消減雜交產物10.0 μL，于65 ℃下反應30 min，最后加入1.5 μL EDTA(100 mmol/L)以及20.0 μL SDW，68 ℃10 min終止反應。

1.4.4均一化消減產物的擴增。將酶切后得到的消減雜交產物通過3輪PCR 進行富集，具體方法參照文獻[6]。

1.4.5擴增產物的連接、轉化和篩選。600 bp以上的PCR擴增產物片段使用PCR Gel extraction kit(Qiagen)進行切膠回收，并使用pLB零背景快速克隆試劑盒(天根生物)進行差異表達片段與pUCmT 載體的連接，進而進行重組質粒的轉化和藍白斑篩選，即構成細菌性條斑菌JH01誘導的水稻抗病基因差減文庫。通過pLB-F和pLB-R引物進行PCR擴增篩選，750 bp以上的擴增片段送上海英濰捷基生物技術有限公司進行序列測序。

1.5測序結果的分析和GO注釋利用VecScreen、EditSeq和SepMan進行序列的識別、去除和拼接；將整理后的序列在GenBank進行同源性比對分析和GO 注釋。

1.6差異基因實時熒光定量PCR鑒定提取接種細菌性條斑病后不同時間段(12、24、36、72 h)的水稻(IR26和兩優培九)葉片，按照“1.3”步驟提取總RNA，進而反轉錄合成第一鏈cDNA。

為了進一步驗證文庫的可靠性，從測序結果中篩選OsNDPK4基因設計特異引物OsNDPK4-a和OsNDPK4-s(表1)，以水稻肌動蛋白基因(actin1基因)為內參，病菌誘導的水稻cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR分析。反應體系(20.0 μL)：7.0 μL ddH2O，10.0 μL 2×SYBR Premix ExTaqTM，0.8 μL PCR-F(10 μmol/L)，0.8 μL PCR-R (10 μmol/L)，1.0 μL 模板cDNA，0.4 μL Rox Reference Dye(50×)。熔點曲線分析條件:95 ℃，15 s；65 ℃，1 min；95 ℃，15 s。熒光定量PCR反應條件：95 ℃ 35 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，45個循環。以actin1 基因作為參照基因進行模板初始量的調整。每個樣品重復3 次，以2-ΔΔCt進行各個基因相對表達水平的統計分析。

2結果與分析

2.1樣品總RNA的提取提取的水稻總RNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測。結果顯示，總RNA呈現 28S 和18S 兩條特異性條帶(圖 1)；OD260/280均在1.9~2.0。說明所提取的 RNA質量較好，可用于后續試驗。

注：1~7.處理組，分別為12、24、36、48、60、72、84 h; 8~14.對照組，分別為12、24、36、48、60、72、84 h。Note：1-7.Treatment group 12,24,36,48,60,72,84 h; 8-14.Control group 12,24,36,48,60,72,84 h.1　總RNA電泳結果圖譜Fig.1　The electrophoretogram of total RNA

2.2水稻cDNA質量的檢測為保證ds cDNA 合成質量，分別采用20、24、28、32個循環對反轉錄得到的cDNA進行PCR擴增，以確定擴增最合適的循環數。由圖2可知，在20個循環條件下看不出有彌散性條帶；24個循環條件下出現彌散性條帶但不是很清晰；28個循環條件下可以非常清晰地看出彌散性條帶且非常亮。而且Driver 和Tester 的ds cDNA 均分布在 0.2~0.3 kb，表明不同大小和豐度的總RNA均得到有效的反轉錄和擴增，合成的ds cDNA質量較高。

注：M.4 500 bp marker; 1~4.20、24、28、32個循環。Note：M.4 500 bp marker; 1-4.20,24,28,32 cycle.圖2　處理組(Driver)水稻雙鏈 cDNA的瓊脂糖電泳檢測Fig.2　The agarose gel electrophoresis of double stranded cDNA in the treatment group (Driver)

2.3消減文庫 cDNA 的檢測3次PCR擴增產物的凝膠電泳圖譜見圖3。由圖3可知，擴增得到一條彌散性條帶，產物大小在0.5~3.5 kb，1.2 kb處條帶較亮，說明大部分的差異表達基因得到很好的富集。

注：M.4 500 bp marker; 1~3.20、25、30個循環。Note：M.4 500 bp marker; 1-3.20,25,30 cycle.圖3　循環數梯度電泳結果Fig.3　The electrophoretogram of cycle gradient

2.4消減文庫質量檢測將得到的差異表達的cDNA與pLB零背景快速克隆試劑盒(天根生物)進行連接，構建消減文庫。分2批從消減文庫中隨機挑選共504條(ZW1~ZW264和W1~W240)進行克隆，進而通過菌液PCR進行差減文庫質量檢測。擴增結果表明，約95%的克隆可以擴增出有效片段，大小主要分布在0.5~2.0 kb(圖4)。說明插入片段完整性較高，所構建文庫質量符合測序要求。

2.5生物信息學分析通過對504條基因序列進行去冗、拼接后，最終獲得98條差異顯示序列。BLAST比對發現59 條序列具有同源基因，占差異顯示序列的60.2%。GO注釋分析發現，59條基因分別參與防衛反應、光合作用、電子鏈傳遞、細胞間信號轉導、糖的代謝、次生代謝等。另外39條序列無相似基因，且尚未有相關功能的報道。

2.6OsNDPK4基因熒光定量表達分析為了進一步鑒定文庫的質量，在已構建的DSN介導的水稻抗細菌性條斑病均一性消減文庫中挑選OsNDPK4，通過實時熒光定量PCR分析該基因在不同水稻中的表達情況，結果見圖6。由圖6可知，接種細菌性條斑病菌后72 h內，基因OsNDPK4受誘導在抗病和感病品種中均表達，且表達量隨時間的延長而提高；在72 h時，基因OsNDPK4在感病品種中表達量下降，在抗病品種中的表達量持續升高。

3結論與討論

該研究采用DSN介導的均一化消減雜交技術構建的cDNA文庫中差異片段大小分布于0.5~2.0 kb，平均大小為1.0 kb左右，文庫質量較好。文庫中很少有大于2.0 kb的cDNA片段，其原因可能是試驗過程中的PCR擴增具有選擇性，導致某些長片段基因丟失，最終獲得98條獨立的差異表達基因。經 BLAST同源性比對分析表明，60.2%差異表達基因具有同源基因。由此說明，DSN介導的均一化消減雜交方法應用于細菌性條斑病菌誘導的水稻抗病差異表達基因的篩選可行、有效，且能獲得全長cDNA。

NDPK(Nucleoside Diphosphate Kinase1)是一個普遍存在的酶類，研究發現，其從細菌到哺乳動物中均起著重要的調控作用。如NDPK通過改變GTP在相鄰G蛋白中的存在來調節G蛋白的活性[8-9]，NDPK還與腫瘤轉移的抑制[10]和果蠅的發育有關[11]。Akihiko等[12]對水稻中已報道的NDPK基因即OsNDPK1、OsNDPK2和OsNDPK3進行了亞細胞定位和組織特異性基因表達，結果發現它們分別定位于細胞溶質、質體和線粒體中，在葉片和葉鞘中均有表達。BR上調OsNDPK1的表達，OsNDPK1調控植物的抗病性和細胞分裂并正調控BR的信號轉導過程[13]。該研究在構建的水稻抗細菌性條斑病均一性消減文庫差異表達ESTs中，獲得了OsNDPK4全長cDNA 序列。熒光定量PCR結果表明，OsND-PK4參與了細菌性條斑病菌JH01誘導的水稻防衛反應。這說明該研究構建的經Xooc侵染誘導的水稻cDNA文庫，為更多抗病基因的分離和功能研究奠定了基礎。

注：M.5 000 bp marker；1~24.從文庫中隨機挑取的陽性克隆W1~W24。Note：M.5 000 bp marker; 1-24.The positive clones W1-W24 were randomly selected from the library.圖4　克隆產物PCR擴增結果Fig.4　The PCR results of cloning products

圖5　cDNA文庫中98條測序ESTs的功能分布Fig.5　Function distribution of 98 ESTs sequences in cDNA library

圖6　水稻細菌性條斑病誘導后OsNDPK4在不同時間的相對表達量Fig.6　OsNDPK4 relative expression quantity after BLS induction in different time

參考文獻

[1] 方中達,任欣正,陳泰英,等.水稻白葉枯病及條斑病和李氏禾條斑病病原細菌的比較研究[J].植物病理學報,1957,3(2):99-124.

[2] CHEN G Y,WANG J S.Exchangeability of twohrpgene fragments fromXanthomonasoryzaepv.oryzaeand pv.oryzicolafor ypersensitive response on obacco and athogenicity on rice[J].Agricultural sciences in China,2003(9):975-981.

[3] 劉銅,劉力行,劉志誠,等.玉米彎孢霉葉斑病菌均一化全長cDNA文庫構建與鑒定[J].植物病理學報,2010,40(3):250-257.

[4] DIATCHENKO L,LAU Y F,CAMPBELL A P,et al.Suppression subtractive hybridization：A method for generation differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries [J].Proceedings of the national academy of sciences USA,1996,93(12)：6025-6030.

[5] 肖永勝,韋雪雪,郜惠蘋,等.一株水稻細菌性條斑病菌的鑒定與遺傳操作系統的建立[J].基因組學與應用生物學,2011,30(33):1211-1217.

[6] 鄭嫩珠,陳曉燕,盧立志,等.半番鴨羽色相關基因均一化差減文庫的構建和鑒定[J].中國農業科學,2012，45(22):4688-4696.

[7] PENG R H,XIONG A S,XUE Y,et al.Kamchatka crab duplex-specific nuclease-mediated transcript to me subtraction method for identifying long cDNAs of differentially expressed genes[J].Analytical biochemistry,2008,372(2)：148-155.

[8] 王玉榮,張雪妍,劉傳亮,等.亞洲棉(GossypiumarboreumL.)全生育期均一化全長cDNA文庫的構建和鑒定[J].中國農業科學,2009,42(4):1158-1164.

[9] BERG P,JOKLIK W K.Transphosphorylation between nucleoside olyphosphates[J].Nature,1953,172：1008-1009.

[10] RANDAZZO P A,NORTHUP J K,KAHN R A.Activation of a small GTP-binding protein by nucleoside diphosphate kinase[J].Science,1991,254(5033)：850-853.

[11] ABLER A,SMITH J A,RANDAZZO P A,et al.Genistein differentially inhibits postreceptor effects of insulin in rat adipocytes without inhibiting the insulin receptor kinase[J].Journal of biological chemistry,1992,267(6)：3946-3951.

[12] AKIHIKO K,WATARU S,SHINJI W.Physiological and biochemical characterization of three nucleoside diphosphate kinase isozymes from rice(OryzasativeL.)[J].Biosci biotechnol biochem,2011,75(9)：1740-1745.

[13] 李生輝.OsNDPK1提高植物抗病性及促進細胞分裂的機理研究[D].保定:河北農業大學,2012.

Construction of a Normalized Subtractive cDNA Library of Rice Inoculated withXanthomonasoryzaepv.oryzacolaJH01

LING Dan-yan,LU Mei*(College of Chemistry and Life Sciences,Zhejiang Normal University,Jinhua,Zhejiang 321004)

Abstract[Objective] A normalized subtractive cDNA library of rice inoculated withXanthomonasoryzaepv.oryzacolaJH01 was constructed,the expression analysis of biological information and disease resistance related genes was conducted on obtained differential expression of ESTs.[Method] In this study,using seedling leaves of rice ‘IR26’ (Tester) and ‘Liangyoupeijiu’ (Driver) as experimental materials,a subtracted cDNA library of rice inoculated byXanthomonasoryzaeJH01was constructed by the method based on subtractive hybridization of the DSN (duplex-specific nuclease) mediated subtractive hybridization.The quality of the subtractive library was detected by PCR amplification using primers pLB-F and pLB-R.[Result] The results demonstrated that the sizes of inserted fragments in the vector were between 0.5-2.0 kb,that the average size was about 1kb,and that 95% of the library clones were recombinants.504 clones were randomly selected,and 98 genes were obtained after clearing pollution,redundant,low quality sequences,and 59 genes were found to have homologous genes in analysis by BLAST.Gene ontology showed that 59 genes were related with resistance signals transduction,elementary metabolic,hypersensitive response,defense response et al.The other 39 sequences had no similar genes,which need further study.By real-time fluorescent quantitative PCR,OsNDPK4 isolated from the library was found to be involved in defense responses in rice induced byXanthomonasoryzaeJH01.[Conclusion] The above suggests that the constructed cDNA library of rice is of good quality and of use for isolation of interacting proteins.

Key wordsBacterial leaf streak; Rice; Duplex-specific nuclease (DSN); Normalized subtractive hybridization; Real-tine fluorescence quantitative PCR

收稿日期2015-12-24

作者簡介凌丹燕(1990- )，女，浙江海寧人，碩士研究生，研究方向：分子植物病理學。*通訊作者，高級實驗師，碩士，從事分子植物病理學研究。

基金項目浙江省自然科學基金項目(Y3110194)。

中圖分類號S 432.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-188-04