心臟生物標志物肌紅蛋白的生物傳感檢測方法

余　文　劉靈芝　謝國明

(重慶醫科大學檢驗醫學院，重慶 400016 )

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綜述

心臟生物標志物肌紅蛋白的生物傳感檢測方法

余文劉靈芝謝國明*

(重慶醫科大學檢驗醫學院，重慶 400016 )

摘要：急性心肌梗死(AMI)有極高的發病率和病死率。心肌損傷標志物肌紅蛋白在心肌梗死后1小時內便開始升高，是AMI發生后最早可檢測的標志物之一。本文重點綜述了基于納米增強比色、局域表面等離子共振、熒光和電化學分析構建的肌紅蛋白檢測生物傳感新方法，探討了各類方法的優缺點及其在AMI即時檢測和早期診斷中的應用。

關鍵詞：急性心肌梗死肌紅蛋白生物傳感

1引言

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI) 起病急，病情兇險，死亡率高。心電圖是經典的用于診斷心臟疾病的方法，但心電圖診斷AMI的陽性率僅為80%，靈敏性不夠高，而且心肌梗死早期不會發生心電圖特征性改變。另外，心電圖不能診斷出非ST段抬高型心肌梗死，易導致臨床搶救不及時，造成嚴重后果。因此，為克服心電圖的局限性，心肌損傷標志物被廣泛用于心肌梗死的診斷。

肌紅蛋白(myoglobin，Mb)作為AMI發生后最早可檢測的標志之一，在AMI發生后1小時內便開始釋放入血，是目前應用最早的心肌損傷標志物。雖然Mb的特異性不高(如肌肉損傷時，Mb也會升高)，但從病史和臨床表現以及與其他指標聯合診斷，能很好地鑒別出AMI，并且AMI患者Mb 的陽性率為92%[1]。此外，Mb的陰性預測價值達100%，即在疑似發生AMI的病人中，2h內Mb在正常范圍，基本可以排除AMI。另外，Mb還可用于判斷再梗死[2]。因此檢測Mb具有重要的臨床意義。一般將血清Mb濃度100ng/mL作為醫學臨界值。傳統的Mb的檢測方法如ELISA、熒光免疫分析、化學發光分析等操作繁瑣，分析費時，且需要大型分析儀器，多需要將樣本送到實驗室或檢驗科進行檢測，耗時，容易延誤病情(表1)。因此，就需要更加簡單、快速的分析方法，能夠在病人發生AMI時即時快速地進行檢測，生物傳感分析方法滿足了這一要求。近年來，Mb的新型傳感檢測方法不斷被研發，其中包括金納米顆粒比色分析、金納米棒的局域表面等離子共振、微流體熒光芯片、熒光免疫層析以及基于石墨烯、ZnS修飾的納米晶、自組裝單分子膜等電化學分析方法(表2)。這類傳感方法具有簡單、快速、靈敏、準確、特異的優點。本文著重討論這些方法的優點與不足，以及其在即時檢測(Point of care test，POCT)和AMI的早期診斷中的應用。

表1　臨床常用方法與新傳感方法比較

表2　肌紅蛋白新傳感方法比較

2肌紅蛋白的傳感檢測方法

2.1比色分析方法

近年來，將金納米粒子運用于比色分析體系，克服了傳統比色分析方法靈敏度不高，不易定量等缺點，實現了靈敏、快速的定量檢測。一種新型的基于脫氧核酶功能化的金納米顆粒的比色方法被報道[3]。該比色方法的原理為：酶標板上固定肌紅蛋白捕獲抗體，當其與樣品中的肌紅蛋白結合后，再通過核酸適體鏈與脫氧核酶功能化的金納米顆粒間接連接，最后加入底物，底物被氧化顯色，實現肌紅蛋白的比色檢測。該方法肌紅蛋白的檢測線可達2.5nM(44ng/mL)，具有良好的選擇性。

2.2局域表面等離子共振傳感方法

表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)是發生于兩種介質臨界面的等離子體的共振，局域表面等離子共振(Local surface plasmon resonance，LSPR)是指在貴金屬納米顆粒如金納米顆粒或納米棒上發生的表面等離子共振[4]。LSPR對周圍介質更敏感。當靶分子結合到固定于金納米顆粒表面的抗體時，能更靈敏地影響其折射率，產生更強的光吸收，導致檢測到更明顯的反射光強的改變，從而將傳感器表面相互作用的靶分子的生物信號更靈敏地轉化為光信號進行檢測。

圖1　金納米粒子增強SPR反向夾心免疫法示意圖

為提高傳統SPR傳感檢測的靈敏度，基于金納米微粒的反向夾心免疫表面離子共振技術已被報導[5]，這是一種新型的高靈敏性的表面等離子共振傳感方法(圖1)。在金納米顆粒表面包被肌紅蛋白二抗，先將其加入待測標本中，使其與標本中的抗原(肌紅蛋白)相結合，形成蛋白-膠體金復合物，此復合物再與生物傳感表面的肌紅蛋白一抗結合，引起更高的折射率的改變，產生檢測信號，該方法最低檢測線可達0.18ng/mL。由于沒有一個生物指標能反映AMI的全過程，因此臨床急需多個心肌標志物聯合檢測，以提高臨床診斷的靈敏性和特異性。Tang L等[6]建立了基于LSPR的生物傳感方法，這是首次運用金納米棒技術同時檢測兩種心肌標志物即CTnT和Mb的LSPR方法。金納米棒是一種尺度從幾納米到上百納米的棒狀金納米顆粒，金納米棒的表面等離子體共振波長可以隨金納米棒的長寬比變化。金納米棒長寬比為2.1和4.2時，它們各自對應的共振波長為640nm和830nm。在這兩種金納米棒表面固定相應的抗體，可分別用于檢測肌紅蛋白和肌鈣蛋白。當生物標本中含有相應的靶分子時，其與相應抗體結合，金納米棒生物傳感器便會將這種生物信號轉變為光信號，且光信號的改變與靶分子的濃度成正比(圖2)。

圖2　基于金納米棒的多路LSPR傳感方法示意圖

以上的檢測方法均利用抗體來特異地結合靶抗原，但抗體的成本相對較高，且抗體不易保存，因此需要不斷探索更加穩定的抗體替代物。目前，已有基于分子印跡聚合物(MIPs)的SPR傳感器被報導。在SPR傳感器表面通過微印跡方法覆蓋一層MIPs修飾的金納米薄膜，用于捕獲肌紅蛋白[7]。該方法最低檢測線26.3ng/mL，功能靈敏度為87.6ng/mL。此傳感方法具有不依賴抗體、價格低，檢測結果易于保存等優點。

總之，LSPR方法是一種無需標記，操作簡單，價格低的分析方法。近年來，其靈敏度不斷被提高，金納米棒的運用實現了多種心肌標記物同時檢測，若將LSPR方法與微流體芯片、矩陣列技術相結合，有望實現床旁即時檢測，盡管目前還沒有在微流體芯片或矩陣列中結合LSPR免疫傳感方法檢測心肌標志物的報道，但是這種方法能實現多通量、多指標的靈敏快速測定，是未來很具潛能的研究方向。

2.3熒光分析方法

熒光檢測方法具有極高的靈敏度，但是傳統的熒光檢測方法操作比較繁瑣，易受背景熒光的干擾，分析成本高。近年，為克服傳統熒光檢測的不足，新型的基于熒光的生物傳感方法被大量研究。

2.3.1改進的熒光分析

為減少背景熒光干擾，提高靈敏度，一種基于超順磁性微球的熒光免疫分析方法被報導。在一種改進的超順磁性微球表面進行雙抗體夾心熒光檢測，用于聯合檢測肌紅蛋白和心型脂肪酸結合蛋白[8]。其對于肌紅蛋白的檢測下限為25ng/mL，對于心型脂肪酸結合蛋白的檢測下限為1ng/mL。此外，將圖像分析技術用于旋轉相位熒光免疫分析是克服背景熒光，提高靈敏度的又一方法[9]。其對肌紅蛋白的檢測線可達700fM。這種新型的分析方法通過CCD相機采集旋轉固相熒光信號，再由特定圖像分析程序得到肌紅蛋白濃度，具有靈敏、快速、簡單的優點。為使熒光檢測方法的操作更加簡單，結果更加靈敏。研究發現將脂質體用于熒光免疫方法檢測肌紅蛋白，比酶聯放大的熒光檢測更具優勢[10]。采用熒光染料封裝的脂質體使得該方法檢測限可達11.3pg/mL，具有極高的靈敏度，檢測速度快(13分鐘完成檢測)，同時脂質體非常穩定，能夠較長時間儲存。

2.3.2基于芯片技術的熒光分析

目前，已有一種新型的基于熒光的肌紅蛋白檢測芯片研制成功[11]。這種芯片在雙抗體夾心的基礎上使用了微流體技術，具有高通量、樣品用量少、分析速度快的特點。通過CCD相機檢測熒光強度，從而對肌紅蛋白進行定量。這種免疫傳感器的線性范圍為20ng/mL~230ng/mL，檢出限為16ng/mL。由該芯片制作的便攜式免疫傳感器盒具有小型性，便攜，簡單，快速的優點，能在10分鐘內迅速獲得結果，適用于POCT。此外，利用該方法的原理，可以在微通道內實現多個心臟標志物的平行檢測，如聯合檢測肌紅蛋白和肌鈣蛋白等，提高AMI的檢出率。

2.3.3基于免疫層析的熒光分析

免疫層析試紙條具有小型便攜、操作簡便、分析快速的優點，是國內外實現POCT應用最為廣泛的方法。其對于肌紅蛋白的檢測已從傳統的定性檢測發展到定量檢測[12,13]。但以往的免疫層析試紙條法多存在靈敏度不高、重復性差，準確度不高等缺點。為提高傳統免疫層析檢測的靈敏度和準確度，大量研究被報道，其中包括將雙納米金粒子用于側向免疫分析法，實現肌鈣蛋白和肌紅蛋白的聯合超靈敏定量檢測，且分析靈敏度分別為9ng/mL和10ng/mL[14]。另外，還有報導將熒光技術用于側向免疫層析試紙條，聯合檢測AMI生物標志物[15]。在一個熒光免疫層析試紙條上，聯合檢測肌紅蛋白、肌鈣蛋白、CK-MB。該方法分析速度快，只需12分鐘便可完成檢測；靈敏度高，其中肌紅蛋白檢測線為1ng/mL。為減少側向熒光免疫分析方法背景熒光的干擾，一種基于二維紙色譜檢測急性心肌梗死標志物的熒光免疫傳感方法被報導[16]，該方法在傳統的側向熒光免疫分析方法基礎上增加了一個自動洗滌過程，對多種心臟標志物進行聯合檢測，其對于肌鈣蛋白、CK-MB、肌紅蛋白的檢測限分別為0.02ng/mL，0.2ng/mL，2ng/mL。

總之，熒光分析方法是靈敏度極高的分析方法，其中熒光芯片技術、熒光定量免疫層析技術，還具有操作簡單、靈敏、特異、準確、樣品用量少及分析速度快的優點。設計為便攜式儀器，可用于POCT。但是，熒光分析方法多需要特殊的熒光檢測儀器進行熒光測定，且熒光抗體一般較貴，不易制備，限制了該類方法的推廣。

2.4電化學分析方法

電化學方法是將生物信號轉變為電信號檢測的一種分析方法。這種方法具有分析速度快、無需標記、不需復雜的樣品預處理、分析范圍廣、靈敏度高、特異性好等優點。目前，納米材料已被廣泛用于各種電化學免疫傳感器，聚苯胺和聚吡咯等有機納米材料的運用，更增加了無機納米材料的生物相容性。為早期診斷急性心肌梗死，用于檢測肌紅蛋白的電化學檢測方法也被廣泛研究。

2.4.1單聚苯胺納米線的電化學方法

單聚苯胺納米線是一種有機納米材料，其比無機納米材料具有更好的生物相容性，基于單聚苯胺納米線的檢測肌紅蛋白的傳感方法已顯示出其獨特的性能[17]。在單聚苯胺納米線的表面固定有肌紅蛋白抗體，用于捕獲樣品中的肌紅蛋白。當肌紅蛋白結合到納米線表面時，引起納米線電導的改變，從而將生物信號轉變為電信號，該傳感器檢測限為1.4ng/mL。為實現多標志物聯合檢測，以及進一步提高檢測靈敏度，單聚苯胺納米線和微流體技術相結合的用于檢測心臟標志物的電導傳感器已被研發[18]。結合單聚苯胺納米線與微流體通道技術，能夠檢測到更低濃度的心肌損傷標志物，其中Myo、CTnI、CK-MB、BNP的檢測下限分別為0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.15ng/mL 、0.05ng/mL。此傳感器線性范圍寬，具高靈敏度和高特異性，檢測速度快(只需幾分鐘)，且可用于多個標志物聯合檢測，適合于即時檢驗。

2.4.2基于ZnS納米晶修飾的電化學傳感方法

羧基功能化的ZnS納米晶是一種半導體納米晶，其易于制備，具有良好的生物相容性，擁有較大的表面積，為抗體的結合提供了豐富的位點。2012年，將巰基丙酸修飾的ZnS納米晶與自組裝單分子膜(SAM)相結合的電阻抗生物電極研制成功[19]。其用于檢測心肌生物標志物肌紅蛋白的線性范圍為10ng/mL～1μg/mL。在ITO玻璃電極表面上覆蓋一層3-氨丙基三乙氧基硅烷自組裝單分子膜，然后在SAM上共價連接3-巰基丙酸修飾的ZnS納米晶。最后將捕獲抗體共價結合到ZnS納米晶的自由羧基上，從而構成抗體/ZnS納米晶/自組裝單分子膜/ITO玻璃的生物電極(圖3)。ITO-SAM-ZnS納米晶電極檢測原理是當抗原與電極表面抗體結合后引起電極電阻抗的改變，從而將生物信號轉變為電信號。

圖3　ITO-SAM-ZnS納米晶電極檢測原理

Sujeet K. Mishra等將修飾后ZnS納米晶用于傳統石墨烯電極表面構成復合生物電極(圖4)，ZnS/RGO復合電極的電阻抗響應靈敏度是普通RGO電極的2.5倍，此復合生物電極對于肌紅蛋白的響應線性范圍是10ng/mL ~1μg/ml[20]。

圖4　ITO-GRO-ZnS納米晶生物電極的制作示意圖

2.4.3基于導電聚合物的電化學傳感方法

導電聚合物具有良好的導電性能,是構建生物傳感器的新型有機納米材料。而聚吡咯納米粒子導電聚合物與其它導電聚合物相比具有良好的環境穩定性和生物相容性，因而在生物傳感器領域應用更為廣泛[21]。有文章報導將吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯納米粒子(AuNP-PPy-PPa)導電聚合物用于石墨烯電極表面構成新型生物電極檢測肌紅蛋白[22]。在玻碳電極的石墨烯表面(RGO)合成含有金納米顆粒的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯納米薄膜(AuNP-PPy-PPa)，構成AuNP-PPy-PPa/RGO多聚納米膜，此多聚納米膜具有具有良好的電化學活性、電化學穩定性。然后在其表面共價偶聯肌紅蛋白抗體，構成免疫阻抗傳感器，在PBS中即可進行電化學阻抗譜分析，實現肌紅蛋白的定量檢測，其檢測的線性范圍為10ng/mL～1μg/mL。

2.4.4雙向液晶分子膜電化學傳感方法

首次運用雙向液晶分子膜于電化學免疫傳感器已有報道[23]，即在玻璃碳電極表面鍍上電活性離子液晶膜，然后在液晶膜表面覆蓋聚乙烯亞胺功能化的金納米顆粒薄膜(AuNP-PEI)，最后連接肌紅蛋白抗體，檢測肌紅蛋白。液晶的應用提高了電極的敏感性和傳導性。該免疫傳感器的檢測的線性范圍為9.96ng/mL~72.8ng/mL，檢測限為6.29ng/mL。

2.4.5Aptamer與MIPs的電化學傳感方法

分子印跡聚合物(MIPs)與寡核苷酸配基(aptamer)均為天然抗體的替代物，克服了天然抗體制備成本較高、化學穩定性較差的缺點。且具有對目標分子有良好的選擇性、熱力學穩定性好、機械強度高、易于制備、可多次重復使用的優點，因此愈加受到了人們的青睞。

已有報導在絲網印刷電極的石墨表面覆蓋一層MIPs檢測肌紅蛋白[24]。該電極具有良好的選擇性和較高的靈敏度，其檢測限達79ng/mL。此外，也有利用aptamer修飾的RGO/碳納米管納米結構電極通過直接電子轉移檢測肌紅蛋白的研究[25]。其檢測限為0.34ng/mL，檢測范圍為1ng/mL~4μg/mL。

2.5其他方法

文獻[26]報導了一種利用個人血糖儀檢測心肌肌紅蛋白的方法，這種方法在聚苯乙烯微孔板里形成肌紅蛋白抗體-肌紅蛋白-酶聯核酸適體的夾心模型，酶使體系中淀粉轉化為葡萄糖，從而利用個人血糖儀檢測出肌紅蛋白濃度。這種方法的靈敏度可達50pM，不需特別儀器，價格便宜，但是此方法分析速度慢，還需進一步研究。

3結束語

AMI是臨床危重癥之一，為實現AMI的即時快速檢測，新型生物傳感檢測方法是研究的熱點。其中納米增強比色方法，在傳統的比色方法上運用金納米離子，提高了比色方法的靈敏度。局域表面等離子共振通過復合金納米棒的運用，實現了無需標記的多項指標聯合檢測。熒光免疫層析分析、順超磁性微球熒光技術等克服了傳統熒光檢測背景熒光、操作復雜、分析費時的缺點。石墨烯、ZnS納米晶、以及聚吡咯納米粒子等導電聚合物運用于傳統的電化學分析，提高了生物電極的導電性、靈敏性、特異性、生物相容性。MIPs與aptamer作為抗體的替代物，與靶分子結合有高度特異性，且易于制備和保存，可多次重復使用，已被用于各種分析檢測。

盡管如此，這些新型傳感方法仍然存在一些不足，如納米增強比色分析易受膽紅素、血脂等干擾；表面等離子共振與熒光分析方法需要特殊的檢測儀器進行檢測，且熒光抗體價格昂貴；電化學分析中電極的穩定性和重復性易受導電聚合物等新型納米材料的固定技術影響。此外，這些檢測方法多用血清或血漿進行檢測，仍需對標本進行離心；且線性范圍多較窄，對高濃度的肌紅蛋白檢測時多需稀釋。今后的研究將探索對全血直接進行檢測，簡化操作步驟，縮短檢測時間，降低檢測成本，同時提高檢測方法的穩定性、重復性等。隨著這些問題的解決，結合納米技術與微流體技術等的生物傳感方法，將實現多項指標的聯合、快速檢測，且靈敏度高，特異性好，能夠實現AMI以及臨床其它疾病的即時檢測。

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《分析儀器》雜志通過國家學術期刊認定

2014年12月10日，《分析儀器》雜志通過國家新聞出版廣電總局認定，成為首批國家認定的學術期刊。在我國，由國家新聞出版行政部門組織對學術期刊進行認定尚屬首次。

Biosensing methods for detection of cardiac biomarker myoglobin.YuWen，LiuLingzhi，XieGuoming

*(DepartmentofLaboratoryMedicine，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)

Abstract:Acute myocardial infarction (AMI) has extremely high morbidity and mortality worldwide. Myoglobin as one of the biomarkers for earlier AMI detection is increased apparently after AMI within 1h. The latest sensing methods of myoglobin detection were reviewed in this paper，including the nano-particals enhancing colorimetric detection，local surface plasmon resonance，fluorescence immunoassays and electrical detection. The advantages，disadvantages and their applications in the point of care test (POCT) and earlier detection of AMI were concluded.

Keywords：acute myocardial infarction; myoglobin；biosensing

收稿日期：2015-06-08

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2016.01.001

作者簡介：余文，女，1993年出生，重慶醫科大學檢驗學院本科生，研究方向為生物傳感與及時檢測，E-mail:109130177.qq.com。