高效液相色譜法測定蘋果酸中的其它有機酸

段先哲　李　南*　譚凱旋　謝焱石　胡　楊　陳　亮　韓世禮　馮志剛　馬　強　劉　珊

(1. 南華大學，衡陽421001；2. 湖南省核燃料循環技術與裝備協同創新中心，衡陽4210001)

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儀器應用

高效液相色譜法測定蘋果酸中的其它有機酸

段先哲1,2李南1,2*譚凱旋1謝焱石1胡楊1陳亮1韓世禮1馮志剛1馬強1劉珊1

(1. 南華大學，衡陽421001；2. 湖南省核燃料循環技術與裝備協同創新中心，衡陽4210001)

摘要：建立了測定蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的高效液相色譜檢測方法。色譜柱為磺酸基Carbomix H-NP (7.8×300mm；10μm)，流動相為0.002mol/L H2SO4，流速為0.5mL/min，進樣量為50μL，檢測波長為210nm，柱溫為55℃。系統適用性實驗中蘋果酸的理論塔板數大于5000，馬來酸與富馬酸分別與相鄰的峰分離度大于1.9，說明此方法檢測蘋果酸中的馬來酸和富馬酸靈敏度高，分離度良好。重復性實驗中6份供試溶液中富馬酸和馬來酸含量的相對標準偏差小于3%，方法精密度良好。3種水平濃度下的加標實驗中，馬來酸和富馬酸平均回收率都在90%～120%之間，相對標準偏差均小于4%，方法準確度良好。該方法可作為蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的定量分析方法。

關鍵詞：蘋果酸馬來酸富馬酸高效液相色譜

蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，它是人體內部循環的重要中間產物，易被人體吸收，廣泛應用于食品和醫藥行業等。在食品行業中，L-蘋果酸是國際上公認的一種安全性食品添加劑,也是一種優良的調酸劑和保鮮劑[1]。在醫藥行業，蘋果酸作為一種藥物成分，常用于藥物制劑、片劑、糖漿和氨基酸溶液中，能明顯提高氨基酸的吸收率以及治療肝病、貧血、免疫力低下等多種疾病，所以需要嚴格控制蘋果酸生產過程中所帶來的雜質(如馬來酸和富馬酸等)。因此，對蘋果酸及其中的馬來酸與富馬酸的測定方法的研究具有重大意義。目前國內有對蘋果酸含量測定的方法有酶法[2]、生物傳感器法[3]、雙波長分光光度法[4]、離子色譜法[5-7]、氣相色譜法[8，9]、毛細管電泳法[10-11]和高效液相色譜法[12-16]等。本實驗建立了測定蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的高效液相色譜檢測方法，采用磺酸基陽離子交換色譜柱，具有更高的分離度和檢測靈敏度。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

蘋果酸(中照力德化工有限公司)；富馬酸標準品(中國食品藥品檢定研究所)；馬來酸標準品(中國藥品生物制品檢定所)；硫酸，分析純；

島津HPLC-20A；CPA225D型電子天平(賽多利斯)。

1.2色譜條件

色譜柱為磺酸基Carbomix H-NP (7.8×300mm；10μm)，流動相為0.002mol/L H2SO4，流速為0.5mL/min ，進樣量為50μL，檢測波長為210nm，柱溫為55℃。

1.3實驗方法

精密稱取馬來酸和富馬酸標準品，加流動相分別配置2μg/mL馬來酸和5μg/mL富馬酸，分別作為馬來酸和富馬酸的標準儲備液。取上述標準儲備液1mL加流動相稀釋到10mL，即得馬來酸和富馬酸混合對照溶液，其中雜質含量均用外標法計算。

2結果與討論

2.1色譜柱的選擇

本實驗采用磺酸基色譜柱。常用的硅膠柱分析有機酸時流動相為水溶液，無有機相，且其pH值低于或接近色譜柱耐受極限，長時間用此極限的流動相條件會極大降低色譜柱柱效及其使用壽命[13]，而磺酸基色譜柱更適用于較低的pH值和無有機相的水溶液流動相，具有更高的分離度和檢測靈敏度。

2.2檢測波長的選擇

用紫外分光光度計分別對蘋果酸、馬來酸和富馬酸溶液進行掃描，得出蘋果酸在210nm處有最強的紫外吸收，馬來酸和富馬酸在210 nm處檢測有很高的靈敏度，所以檢測波長選擇為210nm。

2.3系統適用性

稱取L-蘋果酸用品約30mg，量取混合對照溶液3mL置100mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即為系統適用性溶液。在上述色譜條件下進行測定，結果見表1。結果表明，蘋果酸的理論塔板數大于5000，蘋果酸、馬來酸與富馬酸分別與相鄰的峰分離度大于1.9，說明此方法檢測蘋果酸中的馬來酸和富馬酸具有較高的靈敏度和良好的分離度。

表1　方法的系統適用性實驗

2.4重復性實驗

配置0.1mg/mL蘋果酸樣品溶液6份，分別在上述色譜條件下進行測定，按外標法計算，結果見表2。結果表明，6份供試液中富馬酸和馬來酸含量的相對標準偏差小于3%，方法精密度良好。

表2　重復性實驗測定結果

2.5加標回收率實驗

在蘋果酸樣品中分別加入3種不同濃度的馬來酸和富馬酸標準溶液，每種濃度水平的溶液平行配置3份，分別在上述色譜條件下進行測定，按外標法計算回收率，結果見表3。結果顯示，3種水平濃度下的加標實驗中，馬來酸和富馬酸平均回收率都在90%～120%之間，相對標準偏差均小于4%，方法準確度良好。

表3　方法的回收率

3結論

本實驗建立了一種簡單有效的測定蘋果酸中的馬來酸與富馬酸的檢測方法。結果表明，系統適用性實驗說明此方法檢測蘋果酸中的馬來酸和富馬酸靈敏度較高，分離度良好。重復性實驗中，馬來酸和富馬酸含量的相對標準偏差小于3%，方法精密度良好。3種水平濃度下的加標實驗中，馬來酸和富馬酸平均回收率都在90%～120%之間，相對標準偏差均小于4%。因此，該方法簡便、快速、有效、靈敏、準確、具有良好的精密度和準確度，可作為蘋果酸中馬來酸和富馬酸的定量分析方法。

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Determination of other organic acids in malic acid by high performance liquid chromatography.DuanXianzhe1,2，LiNan1,2*，TanKaixuan1，XieYanshi1，HuYang1，ChenLiang1，HanShili1,FengZhigang1，MaQiang1，LiuShan1

(1.UniversityofSouthChina，Hengyang421001，China; 2.HunanProvinceCooperativeInnovationCenterforNuclearFuelCycleTechnologyandEquipment，Hengyang421001，China)

Abstract:Chromatographic column was Carbomix H-NP (7.8×300mm，10μm); the mobie phase was 0.002mol/L H2SO4; the flow rate was 0.5mL/min.; the injection volume was 50μL; the detection wavelength was 210nm，and the column temperature was 55℃. In the system suitability experiment，the theoretical plate number of malic acid was more than 5000，the resolution of maleic and fumaric acids were greater than 1.9，indicating that this method had a high sensitivity and good resolution for detection of maleic and fumaric acids in malic acid. In the repeated experiment，the relative standard deviation of the concentrations of fumaric and maleic acids in 6 repeated samples was less than 3%，showing a satisfactory precision of this method. In the spiked experiment of three levels，the average recovery of maleic and fumaric acids was between 90% and 120%，all the relative standard deviations were less than 4%，demonstrating that this method was considerably accurate. This method can be used for quantitative determination of maleic and fumaric acids in the malic acid.

Key words:malic acid; maleic acid; fumaric acid; high performance liquid of chromatography (HPLC)

收稿日期：2015-09-14

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2016.01.004

作者簡介：段先哲，男，1985出生，博士，主要從事地球化學、儀器分析及相關研究工作。*通訊作者：李南，女，1985出生，碩士，主要從事分析化學、儀器分析及相關研究工作，Email：linan19851018@163.com。

基金項目：國家自然科學基金(41503016)；湖南省教育廳優秀青年項目(15B201)；中國博士后科學基金(2015M582334)；國防基礎科研計劃項目(B3720110004)；南華大學博士啟動基金(2014XQD08)；南華大學“蒸湘學者計劃”。