肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上TMEM16A的表達(dá)及其阻滯劑對(duì)細(xì)胞增殖的作用

張鋒，龐玉生，勞金泉

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530021)

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上TMEM16A的表達(dá)及其阻滯劑對(duì)細(xì)胞增殖的作用

張鋒，龐玉生，勞金泉

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530021)

目的 研究TMEM16A在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)上的表達(dá)及其阻滯劑(T16Ainh-A01)對(duì)PASMCs增殖的作用。方法組織塊貼壁法分離正常大鼠PASMCs，原代培養(yǎng)。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞免疫化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行鑒定。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TMEM16A在PASMCs上表達(dá)。原代培養(yǎng)的3～6代PASMCs分別在10 μmol/L T16Ainh-A01、20 μmol/L T16Ainh-A01和50 μmol/L T16Ainh-A01下培養(yǎng)24 h，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果倒置顯微鏡下PASMCs以長(zhǎng)梭形為主，細(xì)胞核卵圓形，部分細(xì)胞重疊區(qū)域呈典型的“峰-谷”狀結(jié)構(gòu)。免疫學(xué)檢測(cè)顯示胞漿內(nèi)與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的肌絲被染成棕黃色，標(biāo)記肌絲的紅色熒光也與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行，標(biāo)記細(xì)胞膜上的TMEM16A的綠色熒光可見(jiàn)表達(dá)，而細(xì)胞核不染色。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，相對(duì)于對(duì)照組，10 μmol/L T16Ainh-A01組細(xì)胞活力均數(shù)為(96.74±0.92)%，20 μmol/L T16Ainh-A01組均數(shù)為(92.21±1.25)%，50 μmol/L T16Ainh-A01組均數(shù)為(87.41±3.27)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論正常大鼠PASMCs表達(dá)TMEM16A；T16Ainh-A01可抑制PASMCs增殖，其抑制作用呈濃度依賴性；TMEM16A可能參與調(diào)控PASMCs增殖。

TMEM16A；肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；阻滯劑；細(xì)胞增殖；原代培養(yǎng)

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種與肺血管痙攣和肺血管重塑形成導(dǎo)致肺血管阻力持續(xù)增加密切相關(guān)的異常血流動(dòng)力學(xué)疾病[1]。研究表明各種離子通道引起的膜電位變化調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖[2]。肺動(dòng)脈中層的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)膜上的離子通道[如鈣激活性氯離子通道(CaCC)]參與調(diào)控PAH的發(fā)生。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CaCC的分子基礎(chǔ)是一種稱為跨膜蛋白16A(Transmembrane protein 16A，TMEM16A)[3-5]的物質(zhì)。有研究初步證實(shí)TMEM16A在PASMCs上的表達(dá)，并通過(guò)膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄到了可靠的IClCa[6]。其特異性阻滯劑(TMEM16A inhibitor，T16Ainh-A01)主要用于PASMCs的電生理活動(dòng)[7-8]及Cajal細(xì)胞及胰腺癌等癌細(xì)胞增殖的研究[9]，而對(duì)正常PASMCs增殖的作用尚未報(bào)道。因此本研究目的在于進(jìn)一步探究TMEM16A在正常大鼠PASMCs上表達(dá)情況以及首次用T16Ainh-A01干預(yù)PASMCs，觀察對(duì)細(xì)胞增殖的作用，為尋找PAH治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 180～220 g清潔級(jí)SD大鼠，6～7周齡，雄性SD大鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002)，胎牛血清(FBS，澳洲)、高糖DMEM培養(yǎng)基、含0.1%EDTA胰酶和青霉素-鏈霉素溶液(Wisent公司)，一抗α-actin(Santa公司)，二抗羊抗鼠lgG(H+L)PE標(biāo)記(SBA公司)，一抗兔抗TMEM16A、二抗羊抗兔lgG FITC標(biāo)記和T16Ainh-A01(Sigma公司)，PBS磷酸鹽、DMSO、DAPI溶液和4%多聚甲醛(Solarbio公司)，Triton X-100(Biosharp公司)，DAB試劑盒和羊血清(索萊寶公司)，CCK-8試劑盒(Vazyme公司)，普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標(biāo)儀(Bio-tek公司)等。

1.2 方法

1.2.1 PASMCs的提取 參照文獻(xiàn)[10]并加以改進(jìn)，置于4°C聚苯乙烯磺酸(PSS)液中在顯微鏡下小心分離肺動(dòng)脈(第2～4分支肺動(dòng)脈)。將已分離的肺動(dòng)脈用眼科剪縱向剪開(kāi)，內(nèi)膜面朝上，用眼科彎鑷背面來(lái)回刮幾次以去除內(nèi)膜，再將外膜面朝上，同樣方法刮去外膜。然后漂洗3次肺動(dòng)脈中膜，直到液體清亮，以減少其他細(xì)胞混入。將中膜轉(zhuǎn)移至盛有0.5 mL的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)皿中，用眼科剪反復(fù)剪成約1 mm×1 mm的小組織塊。用滴管將小組織塊轉(zhuǎn)移至25T的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，均勻滴放至瓶底，間距約5 mm。加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，瓶底朝上，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育約2 h。待小組織塊干涸后，輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)基慢慢浸潤(rùn)瓶底上的小組織塊。然后繼續(xù)靜置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 原代培養(yǎng) 前4～6 d不動(dòng)培養(yǎng)瓶，以防止組織塊漂浮，1周左右換液。待細(xì)胞從組織塊周圍游離爬出來(lái)并直至生長(zhǎng)融合成片，此時(shí)用胰酶消化傳代。傳代后一般2～3 d更換培養(yǎng)基，提取和培養(yǎng)PASMCs時(shí)都是用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。采用生長(zhǎng)狀態(tài)較好的3～6代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 PASMCs的鑒定 (1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：在倒置相差顯微鏡下觀察提取PASMCs的形態(tài)；(2)細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定：將第3代的PASMCs接種于24孔板內(nèi)的蓋玻片上，單層鋪滿后，收集細(xì)胞爬片。經(jīng)清洗、固定后，用SP法進(jìn)行α-actin免疫化學(xué)染色，其工作滴度是1:400，DAB試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察拍片；(3)細(xì)胞免疫熒光鑒定：用同樣方法收集細(xì)胞爬片。經(jīng)清洗、4%多聚甲醛固定、0.1%TritonX-100透化和10%山羊血清封閉后加入α-actin一抗4℃孵育過(guò)夜，工作濃度為1:100，再滴加lgG(H+L)-PE標(biāo)記熒光二抗，工作濃度為1:400，DAPI(0.5 μg/mL)染核，最后蓋玻片倒置于滴有甘油的載玻片上，熒光下拍片。

1.2.4 TMEM16A在PASMCs上表達(dá)的檢測(cè) 免疫熒光法：參照文獻(xiàn)[11]并加以改進(jìn)，前面步驟同PASMCs免疫熒光鑒定。加入一抗兔抗TMEM16A，4℃孵育過(guò)夜，工作濃度為1:1，再滴加羊抗兔lgG FITC標(biāo)記二抗，工作濃度為1:5 000，DAPI(0.5 μg/mL)染核，最后蓋玻片倒置于滴有甘油的載玻片上，熒光下拍片。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 選用第3～6代生長(zhǎng)良好的PASMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)處理前換用無(wú)血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞周期同步化，再隨機(jī)分成6組：對(duì)照組與10 μmol/L T16Ainh-A01組、對(duì)照組與20 μmol/L T16Ainh-A01組和對(duì)照組與50 μmol/L T16Ainh-A01組。

1.2.6 CCK-8法對(duì)PASMCs增殖的檢測(cè) 每孔約5×103個(gè)細(xì)胞，將100 μL PASMCs接種至96孔板(邊緣孔用PBS液填充)，設(shè)置空白孔(無(wú)細(xì)胞)、對(duì)照孔(有細(xì)胞，不加藥)和干預(yù)孔(有細(xì)胞，加不同濃度T16Ainh-A01)，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜，第二天倒置顯微鏡觀察基本貼壁。每孔換加入90 μL含10%FBS DMEM培養(yǎng)基和10 μL T16Ainh-A01 (最終濃度為10 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L)，孵育24 h后每孔加入10 μL的CCK-8液，37°C孵育1 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm各孔的吸光度值(OD值)。結(jié)果分析：細(xì)胞活力%=(干預(yù)組OD-空白組OD)/ (對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代PASMCs的形態(tài)學(xué)鑒定 貼壁的小組織塊4～6 d后逐漸有細(xì)胞從周圍爬出來(lái)，以爬出點(diǎn)為中心放射性貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞以長(zhǎng)梭形為主，也有星形或不規(guī)則形，細(xì)胞核呈卵圓形(圖1A)。8～12 d后細(xì)胞大部分鋪滿瓶底，重疊區(qū)域有典型的“峰-谷”生長(zhǎng)特性(圖1B)。

圖1 原代PASMCs的形態(tài)學(xué)鑒定

2.2 原代PASMCs的細(xì)胞免疫化學(xué)和免疫熒光鑒定 α-actin的細(xì)胞免疫化學(xué)顯示，細(xì)胞質(zhì)有較多被染成棕黃色與細(xì)胞縱軸相平行的絲狀物，即為平滑肌細(xì)胞特有的肌動(dòng)蛋白(圖2)。隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)300個(gè)細(xì)胞，見(jiàn)13個(gè)細(xì)胞沒(méi)有著色，判斷PASMCs的陽(yáng)性率達(dá)95.66%。細(xì)胞免疫熒光顯示胞漿內(nèi)有與細(xì)胞縱軸平行的較強(qiáng)的紅色熒光，呈絲狀排列，而細(xì)胞核未染色，表明為目標(biāo)細(xì)胞PASMCs(圖3)。

2.3 TMEM16A在原代PASMCs上表達(dá)檢測(cè) 免疫熒光顯示標(biāo)記PASMCs膜上的TMEM16A可見(jiàn)綠色熒光，較暗，胞核不染色，證實(shí)正常PASMCs上有TMEM16A的表達(dá)(圖4)。

2.4 CCK-8細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著T16Ainh-A01的濃度不斷增高，所測(cè)OD值逐漸減小。相對(duì)對(duì)照組，10 μmol/L T16Ainh-A01組細(xì)胞活力均數(shù)為(96.74±0.92)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；相對(duì)于對(duì)照組，20 μmol/L T16Ainh-A01組細(xì)胞活力均數(shù)為(92.21±1.25)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；相對(duì)于對(duì)照組，50 μmol/L T16Ainh-A01組細(xì)胞活力均數(shù)為(87.41±3.27)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

圖2 PASMCs的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

圖3 PASMCs的細(xì)胞免疫熒光鑒定

圖4 TMEM16A在PASMCs上表達(dá)鑒定

圖5 不同濃度T16Ainh-A01干預(yù)后細(xì)胞活力的比較

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外原代PASMCs的獲取常用的方法有兩種，即酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法雖然有操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量較高等優(yōu)點(diǎn)，但所需消化酶價(jià)格昂貴、消化時(shí)間難以把握，最主要的細(xì)胞相對(duì)不純影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究采取組織塊貼壁法獲得PASMCs[12]，用α-actin的細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，第三代的PASMCs純度達(dá)到95.66%。說(shuō)明該方法原代培養(yǎng)PASMCs仍然不可避免的混雜有其他細(xì)胞，但經(jīng)過(guò)一兩次消化傳代后純度就已較高，基本滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。TMEM16A是一種跨膜蛋白，其表達(dá)廣泛，多種細(xì)胞組織都有表達(dá)，參與多項(xiàng)病理生理活動(dòng)。本研究應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常大鼠PASMCs胞膜上存在TMEM16A的表達(dá)，該結(jié)論也進(jìn)一步證實(shí)了Manoury等[6]和Forrset等[11]的發(fā)現(xiàn)，即TMEM16A在PASMCs上其RNA和蛋白都有表達(dá)，可能參與相應(yīng)疾病的發(fā)生發(fā)展。T16Ainh-A01是直接作用于TMEM16A的特異性阻滯劑，其對(duì)TMEM16A的Cl-電流能明顯抑制并未干擾細(xì)胞信號(hào)通路上游的Ca2+信號(hào)，抑制IC50僅1 μmol/(Lol·L)左右，而相比于會(huì)產(chǎn)生抑制和刺激雙重作用的尼氟滅酸(Niflumic acid，NFA)，其只產(chǎn)生抑制效應(yīng)[7-8，13]。本研究首次使用T16Ainh-A01干預(yù)PASMCs后發(fā)現(xiàn)其可抑制PASMCs的活力，從而抑制PASMCs增殖。進(jìn)一步使用不同濃度的T16Ainh-A01時(shí)發(fā)現(xiàn)阻滯劑濃度與抑制作用呈明顯的正相關(guān)，即呈明顯的濃度依賴性。曾有研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用膜片鉗技術(shù)使用10 μmol/L T16Ainh-A01即可完全抑制細(xì)胞膜上的IClCa[7]。隨著進(jìn)一步深入研究，Mazzone等[9]采用膜片鉗技術(shù)運(yùn)用 10 μ mol/L T16Ainh-A01干預(yù)原代培養(yǎng)的Cajal細(xì)胞電流IClCa受到抑制，與此同時(shí)運(yùn)用T16Ainh-A01干預(yù)原代培養(yǎng)的Cajal細(xì)胞和胰腺癌癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制Cajalx細(xì)胞和胰腺癌癌細(xì)胞的增殖，這證實(shí)TMEM16A可能通過(guò)調(diào)控膜電流參與細(xì)胞增殖。同時(shí)也證實(shí)了慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓和野百合堿介導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓的研究，TMEM16A的表達(dá)增高使得PASMCs上IClCa的密度和強(qiáng)度增加，可能致肺血管重塑和增強(qiáng)血管收縮張力，最終導(dǎo)致PAH的發(fā)生。而加入尼氟滅酸(NFA)，PASMCs上IClCa的密度和強(qiáng)度都會(huì)減弱，且血管張力舒張明顯[11]。然而，近來(lái)有一研究腦血管疾病的報(bào)道發(fā)現(xiàn)TMEM16A通過(guò)減少平滑肌細(xì)胞內(nèi)周期蛋白D1和周期蛋白E的表達(dá)來(lái)使細(xì)胞停留在G0/G1時(shí)期，從而抑制細(xì)胞增殖，這也說(shuō)明了在不同的細(xì)胞組織其可能發(fā)揮著不同的功能[14]。

綜上所述，本研究證實(shí)了TMEM16A在PASMCs上的表達(dá)，T16Ainh-A01的作用也為TMEM16A在細(xì)胞周期中起的作用提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。但該抑制劑只是針對(duì)離體正常的PASMCs，而在肺動(dòng)脈高壓下其對(duì)PASMCs作用以及TMEM6A是以怎樣的信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖及重塑的還需日后進(jìn)一步研究。

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Expression of TMEM16A in pulmonary arterial smooth muscle cells and effect on cell proliferation by a selective TMEM16A inhibitor.

ZHANG Feng,PANG Yu-sheng,LAO Jin-quan.Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the expression of TMEM16A in rat pulmonary arterial hypertension (PASMCs)and effect of a TMEM16A inhibitor(T16Ainh-A01)on cell proliferation.MethodsTissue block anchorage was employed for the primary culture of rat PASMCs.Under light microscope,cell morphology was observed and identified by immunocytochemistry and immunofluorescence.The expression of TMEM16A in PASMCs was detected by immunofluorescence.The 3～6 passages of primary cultured PASMCs were respectively exposed to 10 μmol/L T16Ainh-A01,20 μmol/L T16Ainh-A01 and 50 μmol/L T16Ainh-A01 for 24 hours.Cell proliferation was detected by cell counting kit-8(CCK-8)assay.ResultsPASMCs tended to be long spindle,nuclear oval,and partial overlapping regions of the cells grew in a typical"peak-valley"mode under light microscope.Immunology results showed that the filaments in cytoplasm paralleled to cell long axis were stained brownish yellow and the red fluorescent marked filament paralleled to cell long axis were also showed.Meanwhile,TMEM16A marked with green fluorescence were visible,and the nuclear were non-staining.In CCK-8 assay,compared to control group,mean cell viability of 10 μmol/L,20 μmol/L, 50 μmol/L T16Ainh-A01 group was(96.74±0.92)%,(92.21±1.25)%,(87.41±3.27)%,respectively,and the differences were statistically significant(P＜0.01).ConclusionTMEM16A were exactly expressed in normal PASMCs.T16Ainh-A01 could inhibit the proliferation of PASMCs,and its inhibitory effect was concentration-dependent.TMEM16A may regulate PASMCs proliferation.

TMEM16A;Pulmonary arterial smooth muscle cells;Inhibitor;Cell proliferation;Primary culture

R-332

A

1003—6350（2016）11—1727—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.002

2016-03-02)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81160040)；廣西自然科學(xué)基金(編號(hào)：2013GXNSFAA019177)

龐玉生。E-mail:pangyush@163.com