苗藥頭花蓼提取物血清藥理學研究方法的建立及驗證

徐丹，趙菲菲，劉俊，楊馨，李靖，徐國波，廖尚高

(1.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；2.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

苗藥頭花蓼提取物血清藥理學研究方法的建立及驗證

徐丹1，2，趙菲菲1，3，劉俊1，2，楊馨1，3，李靖1，2，徐國波1，2，廖尚高1，2

(1.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；2.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

目的 建立并驗證頭花蓼提取物血清藥理學研究方法。方法以大鼠為含藥血清的供體，MTT法確定空白血清及含藥血清對小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7細胞)活性的影響，采用10 ng/mL脂多糖(LPS)建立RAW264.7細胞炎癥損傷模型，Griess試劑法檢測細胞上清液中一氧化氮(NO)的釋放量，以確定體系中的血清添加量和大鼠取血時間。以NO、TNF-α為指標測定含藥血清的抗炎活性。結果大鼠按人臨床用藥等效劑量的27倍給予頭花蓼水提醇沉提取物，與模型組相比，體系中加入1.5%(V/V)末次給藥后90 min的含藥血清能夠顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO(P＜0.001)。同時，該方法制備的含藥血清能夠顯著抑制細胞釋放NO和TNF-α (P＜0.01或P＜0.001)。結論本實驗條件下制備的頭花蓼含藥血清具有明顯的抗炎作用，該血清藥理學方法可用于頭花蓼提取物含藥血清藥效及作用機制研究。

頭花蓼；RAW264.7細胞；血清藥理學

頭花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham.Ex D. Don)為蓼科蓼屬植物頭花蓼的干燥全草，是貴州地道藥材，收載于2003版《貴州省中藥、民族藥質量標準》中，具有利尿通淋之功效，臨床上主要用于泌尿系統感染疾病的治療[1]。其水提物單方制劑熱淋清顆粒對尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎的療效突出[2]。泌尿系統感染是尿路受到病原微生物侵襲而導致的炎癥反應。抑制炎癥反應，防止泌尿系統感染的惡化，對此類疾病的治療具有重要意義[3]。

中藥血清藥理學反映了有效成分在血中的動態變化及相互作用，避免了藥物的物理化學性質對實驗結果的影響，能夠更好地模擬藥物在體內發揮作用的過程[4]，有利于探討中藥在體內直接發揮藥效的物質及作用機制。前期研究表明，頭花蓼中三萜、甾體和黃酮類化合物與抗炎活性密切相關[5]，但其作用機制目前尚不明確。因此本研究為建立頭花蓼提取物血清藥理學研究方法，以大鼠為含藥血清供體，RAW264.7細胞為研究對象，結合藥效學實驗，考察細胞存活率、空白血清對細胞的影響及制備含藥血清的取血時間等影響因素，最后以NO、TNF-α為指標對該方法進行驗證，確保該方法準確可靠，以期為頭花蓼的抗炎藥效及作用機制的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試藥與試劑 頭花蓼藥材購于貴州省施秉縣頭花蓼GAP種植基地(經度108.11°，緯度27.03°，藥材購置時間為2014年8月)，由貴州醫科大學生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科蓼屬植物頭花蓼的全草。陽性對照藥醋酸地塞米松磷酸鈉注射液，貴州光正制藥有限責任公司生產，國藥準字H52020793，批號130315。DMEM高糖培養基(Gibco公司，批號8114410)，胎牛血清(Hyclone公司，批號NZE1145)，脂多糖(LPS，Sigma公司，批號102M4017V)，MTT(Sigma公司，批號M1959)；磺胺(批號30172216)，N-(1-萘基)-乙二胺(批號80088013)，DMSO(批號302A0323)，均來源于中國醫藥集團總公司(國藥集團)。

1.2 動物與細胞株 Wistar大鼠，雌雄各半，體質量(200±20)g，SPF級，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(黔)2012-0001。動物適應性飼養3 d后，供試。小鼠單核巨噬細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 儀器 CO2培養箱(美國Thermo scientific公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，超低溫冰箱(Thermo Fisher公司)，680型酶標儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司)，數顯立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療儀器廠)，超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，所用細胞培養瓶、培養板、離心管均為美國Corning公司產品。

1.4 方法

1.4.1 頭花蓼提取物血清藥理學方法的建立

1.4.1.1 頭花蓼水提醇沉提取物(PCWEP)的制備[6]頭花蓼全草粉末9.6 kg(一號篩)水提取4次，每次2 h，合并濾液回收至浸膏得頭花蓼水提物；水提物用水溶解后加入3倍量95%乙醇沉淀24 h，過濾，合并濾液回收至浸膏得890 g PCWEP，得率為9.3%，每克PCWEP相當于10.8 g生藥，其中富含槲皮素、沒食子酸、山柰酚、兒茶素以及多種酚酸類等化合物[7]。

1.4.1.2 空白血清和含藥血清的制備[8]Wistar大鼠6只，灌胃前12 h禁食不禁水，尾靜脈采集空白血，然后按162 g/kg·d生藥量(頭花蓼單方制劑熱淋清顆粒臨床劑量的27倍)灌胃給予PCWEP藥液，每天兩次，連續4 d，末次給藥后10 min、20 min、40 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min尾靜脈取血。以2 000 r/min，4℃離心10 min分離上層血清，過濾除菌，分裝，-20℃保存備用。

1.4.1.3 空白血清及PCWEPS對細胞活性的影響 RAW264.7細胞培養于含10%胎牛血清，100 μg/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM細胞培養液中，置于溫度為37℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以2×105個/mL的濃度接種于96孔培養板中，每孔體積100 μL，細胞培養24 h后，棄去上清。實驗分為：(1)對照組(CON)：無大鼠血清的培養基；(2)實驗組：不同體積分數(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%V/V)的空白血清或頭花蓼水提醇沉提取物含藥血清(PCWEPS)，培養24 h后，每孔加入2.5 g/L MTT溶液10 μL，繼續孵育4 h，移液器吸走上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，在酶標儀上于490 nm波長處測定吸光度(A)，每組設6個平行孔。按照公式：細胞存活率=實驗組A/對照組A平均值× 100%，計算細胞存活率。通過評價不同體積分數的空白血清及PCWEPS對RAW264.7細胞活性的影響，確定實驗中對RAW264.7細胞活性無影響的空白血清及含藥血清的體積分數。

1.4.1.4 空白血清和不同時間點含藥血清對細胞釋放NO的影響 空白血清對細胞釋放NO的影響實驗，參照2.1.3項，每孔體積100 μL。實驗分為：(1)對照組(CON-1)：無大鼠血清的培養基；(2)空白血清組(CON-2)：體積分數(V/V)為1.5%的空白血清培養液；(3)無血清模型組(LPS-1)：終濃度為10 ng/mL的LPS溶液；(4)空白血清模型組(LPS-2)：終濃度為10 ng/mL的LPS和空白血清體積分數(V/V)為1.5%的培養液。不同時間點含藥血清對細胞的影響實驗，分為：(1)對照組(CON)：無大鼠血清的培養基；(2)模型組(LPS)：終濃度為10 ng/mL的LPS溶液；(3)DEXA組(地塞米松)：終濃度為50 μg/mL的地塞米松和10 ng/mL的LPS混合液；(4)不同時間點含藥血清組：終濃度為10 ng/mL的LPS和體積分數(V/V)為1.5%的不同時間點含藥血清，與細胞共培養24 h后，吸取細胞培養液上清50 μL至酶標板中，加入等體積的Griess試劑(1%磷酸磺胺溶液與0.1%N-(1-萘基)-乙二胺等體積混合液)，室溫反應10 min后于540 nm波長處測定其孔吸光度A，每組設6個平行孔。根據NaNO2標準曲線計算細胞培養液上清中NO的釋放量，通過評價空白血清和不同時間點含藥血清對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響，確定實驗中合適的血清添加體積和取血時間。

1.4.2 頭花蓼提取物血清藥理學方法的驗證

1.4.2.1 不同劑量頭花蓼水提醇沉提取物含藥血清的制備 Wistar大鼠50只，灌胃前12 h禁食不禁水，根據灌胃劑量隨機分成五組：分別為2 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)、18g/(kg·d)、54g/(kg·d)、162g/(kg·d)(生藥量：0.33倍、1倍、3倍、9倍、27倍的頭花蓼單方制劑熱淋清顆粒臨床劑量)PCWEP組，每組10只。分別灌胃，2次/d，連續4 d，末次給藥后90 min尾靜脈取血。以2 000 r/min、4℃離心10 min分離上層血清，合并同組血清，過濾除菌，分裝，-20℃保存備用。

1.4.2.2 不同劑量PCWEPS對細胞釋放NO的影響 參照2.1.4項，實驗分為(1)正常對照組(CON組)：無大鼠血清的培養基；(2)模型組(LPS組)：培養基中加入終濃度為10 ng/mL的LPS；(3)地塞米松組(DEXA組)：培養基中加入終濃度為50 μg/mL的地塞米松和10 ng/mL的LPS共培養；(4)不同劑量PCWEPS組：培養基中加入終濃度為10 ng/mL的LPS和體積分數(V/V)為1.5%的不同劑量PCWEP的含藥血清共培養。根據NaNO2標準曲線計算細胞培養液上清中NO的釋放量，以此評價不同劑量的PCWEPS對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響。

1.4.2.3 不同劑量PCWEPS對細胞釋放TNF-α的影響 參照2.2.2項，每組設6個平行孔。收集細胞上清液，TNF-α的含量采用ELISA試劑盒提供的方法進行測定。根據標準曲線計算TNF-α的釋放量，以此評價不同劑量的PCWEPS對LPS誘導RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析。計量數據用均數±標準差(±s)表示，單因素方差分析(One-Way ANOVA)后，用Dunnett's test分析方法比較組間差異。兩組間比較采用t-test法。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 空白血清及PCWEPS對細胞活性的影響 當空白血清及不同時間點PCWEPS體積分數(V/V)為0.5%～1.5%時，作用細胞24 h，與對照組(CON)比較，細胞存活率差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 空白血清及PCWEPS對細胞活性的影響(±s，n=6)

表1 空白血清及PCWEPS對細胞活性的影響(±s，n=6)

注：PCWEPS，頭花蓼水提醇沉提取物含藥血清(表3～表5同)；a與對照組比較，P＜0.01。

組別F值P值體積分數(V/V)細胞存活率(%)對照(CON-1)空白血清(CON-2) -0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 100.00±0.50 100.76±0.36 100.93±0.37 99.62±0.25 94.32±0.43a100.80±0.39 100.75±0.28 99.60±0.20 94.79±0.34a100.66±0.43 100.79±0.13 99.72±0.39 95.86±0.34a101.38±0.51 101.10±0.31 100.00±0.41 94.74±0.38a101.26±0.46 100.85±0.23 100.30±0.40 96.11±0.21a101.59±0.53 101.09±0.45 99.88±0.24 94.63±0.44a100.89±0.31 100.05±0.47 98.54±0.45 95.14±0.25a100.50±0.21 100.28±0.20 99.57±0.28 95.16±0.47a100.08±0.22 99.67±0.42 98.40±0.43 95.36±0.41a49.182＜0.01 PCWEPS(10 min) 53.047＜0.01 PCWEPS(20 min) 29.073＜0.01 PCWEPS(40 min) 37.144＜0.01 PCWEPS(60 min) 29.794＜0.01 PCWEPS(90 min) 31.791＜0.01 PCWEPS(120 min) 24.308＜0.01 PCWEPS(180 min) 56.566＜0.01 PCWEPS(240 min) 19.206＜0.01

2.2 空白血清對細胞釋放NO的影響 采用1.5%體積(V/V)的空白血清作用于10 ng/mL LPS誘導的RAW264.7細胞24 h，與空白對照組比較，無血清模型組(LPS-1相對于CON-1)和空白血清模型組(LPS-2相對于CON-2)差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)；空白血清組(CON-2)與對照組(CON-1)比較差異無統計學意義，空白血清模型組(LPS-2)與無血清模型組(LPS-1)比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 空白血清對RAW264.7細胞釋放NO的影響(±s，n=6)

表2 空白血清對RAW264.7細胞釋放NO的影響(±s，n=6)

注：a與CON-1組比較，P＜0.01；b與CON-2組比較，P＜0.01。

組別對照(CON-1)空白血清(CON-2)無血清模型(LPS-1)空白血清模型(LPS-2)體積分數(V/V) 1.5% 1.5% NO(μmol/L) 2.12±0.55 1.85±0.56 18.58±1.34a18.13±1.29b

2.3 取血時間點的確定 與對照組(CON)比較，模型組(LPS)顯著誘導RAW264.7細胞釋放NO (P＜0.01)；與模型組(LPS)比較，不同時間點的PCWEP含藥血清(PCWEPS)均能顯著抑制RAW264.7細胞釋放NO(P＜0.01)，其中90 min含藥血清組抑制NO釋放的作用略優于其他時間含藥血清組，見表3。

表3 PCWEPS取血時間對RAW264.7細胞釋放NO的影響(±s，n=6)

表3 PCWEPS取血時間對RAW264.7細胞釋放NO的影響(±s，n=6)

注：DEXA，50 μg/mL地塞米松(表4～5同)；與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

組別 取血時間(min)NO(μmol/L)對照模型DEXA PCWEPS 10 20 40 60 90 120 180 240 3.13±0.18 16.30±0.81a4.46±0.16b14.41±0.29b14.29±0.55b13.97±0.38b12.99±0.23b10.82±0.34b11.73±0.16b12.36±0.17b12.79±0.20b

2.4 不同劑量PCWEPS對細胞釋放NO的影響 與正常組(CON組)相比，模型組(LPS組)顯著刺激RAW264.7細胞釋放NO(P＜0.01)；與模型組(LPS組)相比，不同劑量的PCWEPS能顯著抑制RAW264.7細胞釋放NO(P＜0.01)，且呈明顯的劑量依賴性，見表4。

2.5 不同劑量PCWEPS對細胞釋放TNF-α的影響 與正常組(CON組)相比，模型組(LPS組)顯著刺激RAW264.7細胞釋放TNF-α(P＜0.01)；與模型組(LPS組)相比，不同給藥劑量的PCWEPS均能顯著抑制RAW264.7細胞釋放TNF-α(P＜0.01)，且呈明顯的劑量依賴性，見表5。

表4 不同劑量PCWEPS對RAW264.7細胞釋放NO的影響(±s，n=6)

表4 不同劑量PCWEPS對RAW264.7細胞釋放NO的影響(±s，n=6)

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

組別 劑量(g/kg·d)NO(μmol/L)對照模型DEXA PCWEPS 2 6 1 8 54 162 1.59±0.17 16.22±0.10a3.30±0.18b15.97±0.13 14.82±0.15b14.39±0.19b12.54±0.12b10.25±0.24b

表5 不同劑量PCWEPS對RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響(±s，n=6)

表5 不同劑量PCWEPS對RAW264.7細胞釋放TNF-α的影響(±s，n=6)

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

組別 劑量[g/(kg·d)]TNF-α(ng/L)對照模型DEXA PCWEPS 2 6 1 8 54 162 1 265.22±34.11 11 428.26±27.32a2 741.67±31.96b9 287.23±21.28b7 965.13±15.74b7 113.04±30.71b6 785.15±17.90b5 210.87±31.09b

3 討 論

頭花蓼是貴州苗族民間常用藥材，廣泛用于泌尿系統感染的治療，療效確切。過度的炎癥反應是泌尿系統感染的主要機制之一[9]，在機體炎癥反應的過程中，巨噬細胞是一個重要參與者，在被感染過程中，被激活的巨噬細胞能釋放致炎因子一氧化氮(NO)，過量炎癥因子的釋放會加重炎癥反應[10]；TNF-α作為一個重要的早期炎癥因子，可誘發IL-6以及繼發性炎癥因子NO的釋放[11]。故抑制巨噬細胞中炎癥因子NO和TNF-α的過度釋放對炎癥性疾病的治療意義重大。中藥血清藥理學與傳統的藥物直接作用于細胞或器官的體外實驗相比能較好地模擬藥物在體內環境中產生藥理效應的真實過程。因此，本研究選擇NO為指標，建立頭花蓼提取物含藥血清的藥理學評價方法，并以NO、TNF-α為指標測定含藥血清的抗炎活性，從而對該血清藥理學方法進行驗證。

含藥血清加入體外反應體系后可能有促進細胞增殖或產生細胞毒性的作用，為排除此類影響，本實驗采用MTT法檢測不同體積分數的空白血清及PCWEPS對RAW264.7細胞活性的影響。結果發現，當空白血清及含藥血清體積分數(V/V)為0.5%～1.5%時，作用細胞24 h，與對照組(CON)比較，細胞存活率差異無統計學意義，提示在此體積范圍內空白血清及含藥血清對RAW264.7細胞本身的生長無顯著影響，超過此添加量，隨著血清體積的增加，RAW264.7細胞的生長受到顯著影響。為有效反映藥物的藥效，在后續實驗中，血清體積分數(V/V)設定為1.5%。為避免血清本身的活性化合物帶來的假陽性結果，本研究發現當空白血清體積(V/V)為1.5%時，既不影響RAW264.7細胞的活性，也不影響LPS刺激所產生的NO釋放的檢測，故選擇1.5%(V/V)含藥血清作為體系中的最佳添加量。由于藥物進入體內即被吸收，為了突出含藥血清的藥效，將不同時間點含藥血清的藥效進行比較后確定取血時間較為科學可靠。本研究發現末次給藥后90 min含藥血清抑制RAW264.7細胞NO釋放的作用略優于其他時間點含藥血清，并將該時間點作為制備含藥血清的取血時間。與模型組(LPS組)相比，不同劑量的PCWEPS能顯著抑制RAW264.7細胞釋放NO(P＜0.01)，且呈明顯的劑量依賴性，因此，PCWEPS的抗炎作用可能與抑制細胞釋放NO有關。與模型組(LPS組)相比，不同給藥劑量的PCWEPS均能顯著抑制RAW264.7細胞釋放TNF-α(P＜0.01)，且呈明顯的劑量依賴性，因此，PCWEPS的抗炎作用可能與抑制細胞釋放TNF-α有關。

因此，頭花蓼提取物含藥血清的藥理學評價方法為：Wistar大鼠(200±20)g數只，雌雄各半，隨機分組。分別灌胃不同劑量的頭花蓼提取物，2次/d，連續4 d，末次給藥后90 min尾靜脈取血。以2 000 r/min、4℃離心10 min分離上層血清，過濾除菌，分裝，-20℃保存備用。含藥血清對LPS誘導RAW264.7細胞釋放炎癥因子的影響實驗中，分為：(1)對照組；(2)模型組(10 ng/mL LPS)；(3)DEXA組(50 μg/mL地塞米松)；(4)不同劑量含藥血清組(1.5%V/V)。

本研究建立了頭花蓼提取物含藥血清的藥理學研究方法，該方法能夠較好地反映頭花蓼的藥效，為后續頭花蓼作用機理的研究奠定基礎，同時也為其他中藥血清藥理方法學的建立提供參考。

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Establishment and validation of serum pharmacological method for Polygonum capitatum extract(an Ethnic Miao's Herb).

XU Dan1,2,ZHAO Fei-fei1,3,LIU Jun1,2,YANG Xin1,3,LI Jing1,2,XU Guo-bo1,2,LIAO Shang-gao1,2. 1.School of Pharmacy,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,CHINA;2.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM,Ministry of Education,Guiyang 550004,Guizhou,CHINA; 3.Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou Province,Guiyang 550004,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo establish and validate a serum pharmacological method for Polygonum capitatum extract.MethodsRats were used as the provider to prepare the drug-containing serum.Cell viability was detected to determine the effect of blank and drug-containing serum on murine mononuclear macrophage cells(RAW264.7 cells)by MTT assay.The inflammatory cell model was produced by 10 ng/mL lipopolysaccharide(LPS)treated RAW264.7 cells. Nitric oxide(NO)production was detected by the Griess assay to determine the suitable concentration of serum in culture system and the time of sample collection.NO and TNF-α were selected to validate the anti-inflammatory activity of the drug-containing serum.ResultsRats were given oral administration of protein-free water extract of Polygonum capitatum(PCWEP)by 27 times dose of adults.1.5%(V/V)serum after 90 min of the last administration could significantly inhibit the release of NO in LPS-induced RAW264.7 cells compared with the model group(P＜0.001).Drug-containing serum prepared by this method could significantly inhibit the productions of NO and TNF-α in RAW264.7 cells(P＜0.01,P＜0.001).ConclusionDrug-containing serum prepared by this method possesses obvious effect of anti-inflammatory in macrophage cells,and this serum pharmacological method can be applied to evaluate the pharmacological effect and mechanism of PCWEPS.

Polygonum capitatum;RAW264.7 cells;Serum pharmacology

R965.2

A

1003—6350（2016）11—1737—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.005

2016-03-31)

國家自然科學基金（編號：81160516、81560570、81260688）

廖尚高。E-mail:lshangg@163.com