水凝膠在脊髓損傷修復中的應用

馬偉康，陶樹清

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱　150086)

水凝膠在脊髓損傷修復中的應用

馬偉康，陶樹清

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱150086)

[摘要]脊髓損傷是一種嚴重的外傷性疾病，可以導致永久性的運動和感覺功能喪失。由于病變部位及周圍不利于脊髓損傷修復的微環境，脊髓損傷的治療沒有有效的策略。此外，膠質瘢痕形成和炎癥反應抑制軸突生長，形成抑制脊髓損傷修復的屏障。水凝膠目前是一種理想的運輸工具，因為它可以模仿細胞外基質給細胞提供支持，促進其增殖、遷移、分化，引導植入的神經組織修復和替代受損組織。通過水凝膠將細胞和分子運輸到損傷部位具有廣闊的前景，并被應用于脊髓損傷修復。本文中作者將介紹水凝膠作為運載工具的特點和優勢，及水凝膠在細胞及細胞分子植入脊髓損傷部位的應用。

[關鍵詞]脊髓損傷； 水凝膠； 組織再生； 細胞； 分子; 綜述

脊髓損傷(spinal cord injury)是一種極具挑戰性的外傷性疾病，在臨床上常常導致損傷部位以下永久性的運動和感覺功能障礙。臨床嘗試了許多方法，但是都收效甚微[1]。隨著組織工程學的飛速發展，對脊髓損傷的有效治療必須包括組織水平的重建，在誘導軸突生長的同時減少膠質瘢痕的形成[2]。以細胞及細胞分子為基礎的治療策略給我們未來治療脊髓損傷帶來希望。但傳統的攝入方法如口服和靜脈給藥難以通過血腦屏障(blood- brain barrier)和血- 腦脊液屏障(blood cerebrospinal fluid barrier)，極低的滲透率使得傳統方法無效[3- 4]。我們需要一個理想的輸送系統，來實現細胞和分子局部持續的釋放。近來水凝膠成為研究熱點，因為他們可以模仿細胞外基質，為神經細胞黏附、增殖和分化提供支持。在本文中，作者將突出介紹以水凝膠為基礎的細胞及分子治療在脊髓損傷修復中的特點。

1理想的運輸系統

由于傳統方法的局限性，我們需要設計出一個理想的輸送系統實現局部持續的釋放。理想的運輸系統應有的特點：(1) 材料的生物相容性。不會引起免疫反應，降低宿主組織和移植組織之間可能出現的排斥反應[2,5]。移植后，移植的細胞和分子仍然有自己的生物活性。(2) 材料的穩定性。運輸工具足夠穩定以避免不利的環境因素如溫度、pH值等，為組織再生提供長期的支持。(3) 材料的可降解性。植入材料必須是可降解的，殘留的材料可能導致免疫反應、炎癥反應和病變部位體積增大導致脊髓壓縮。同時對降解速率也有要求，材料降解的速率應足夠慢，使神經元有足夠的時間生長、分化或產生有利的細胞分子。材料的降解速率應實現控制和可調[6]。(4) 無毒性。用于移植到脊髓損傷部位的材料應該具有安全性，對注射部位和宿主的組織或其他器官不產生傷害。這些材料應滿足安全要求，并在移植前進行測試。(5) 效率。材料的設計應實現低投入、高產出。由于生物材料的高濃度注射可能導致局部體積過大，在有限容量內脊髓受壓，并增加了副作用的風險。(6) 生物活性。材料的生物活性是由包括孔隙大小長度等不同的因素決定的，生物材料的納米孔大小對細胞生長、遷移和生物活性分子的擴散極為重要。三維(3D)的孔隙結構可以模仿天然的細胞外基質和提供細胞間連接，決定細胞的生存和生長。材料的機械性能應類似于宿主組織，使生物材料結構可以承受周圍組織產生的力，據報道生物材料剛度對細胞也有影響[6]。

2水凝膠的特點

水凝膠是含水量高和體表面積大的天然或合成的聚合物網絡狀物質，當植入到脊髓組織中可以為細胞和軸突提供力學支持,通過修飾可以具有生物降解性，并實現可控釋放細胞分子[7- 8]。此外，水凝膠可以模仿天然的細胞外基質的結構和功能[6,9]。水凝膠的結構和特性可以促進細胞生長、遷移，介導組織修復和再生[9- 10]。未來水凝膠的應用要求具有合成容易、穩定性、安全性和療效性等特點。水凝膠可以進行物理、化學性交聯，每類交聯的水凝膠有自己的優點和缺點?；瘜W交聯的水凝膠具有較長存活期，但需要快速形成共價鍵，避免被消除?；瘜W交聯的水凝膠要求沒有細胞毒性交聯物，而物理交聯水凝膠似乎對環境刺激更敏感(溫度和pH)。共價鍵的缺乏使得水凝膠注射后容易被消除，因此高濃度的水凝膠注射是必需的，但可能導致脊髓受壓。目前，結合物理交聯和化學交聯的復合交聯具有很好的研究前景[11]。

3測量水凝膠特性的方法

水凝膠的不同性質需要不同的測量方法。機械性能需要在干濕條件下進行動態力學檢測?？紫堵实臏y試需要采用微型計算機斷層掃描電子顯微鏡測試。水凝膠的毒性是通過對神經元存活和水凝膠系統內神經元生長情況分析后測定的。行為功能的恢復測試通過Basso Beattie and Bresnahan試驗和動態負重試驗(dynamic weight bearing test)。組織學分析揭示了是否有新的神經元和血管的生成、膠質瘢痕形成、炎癥反應和脫髓鞘化。水凝膠的降解性能通過質量損失測量[12]。

4以細胞治療和分子為基礎的治療策略

水凝膠可以支持損傷的脊髓組織，防止瘢痕形成，促進組織再生。3D結構孔隙和通道的水凝膠結合具有治療作用的細胞和分子，可以提供有利的生長環境促進組織長入。以水凝膠為基礎的細胞和分子治療為脊髓損傷修復的攻克帶來希望。

4.1基于細胞的策略

在過去幾十年中，將治療性細胞傳遞到病變部位一直是最常用的治療策略之一，這種方法不僅能刺激神經再生、修復丟失的細胞，而且還可以提供包括抗炎和生長因子等營養分子，這些細胞的活動可以調節和促進脊髓損傷后的組織再生。在這些以細胞為基礎的治療中，干細胞移植是促進組織再生的一種有前途的方法，結合神經干細胞和水凝膠的試驗已經被研究。成人神經干/祖細胞(adult neural stem/progenitor cells)是一種很有前途的移植細胞，因為他們可以自我更新，分化為少突膠質細胞、星形膠質細胞和神經元。有研究人員將腦來源的干/祖細胞結合大鼠血小板衍生生長因子(rPDGF- A)修飾后的透明質酸和甲基纖維素(hyaluronan and methyl cellulose)注射到亞急性大鼠脊髓損傷模型中，這一試驗證實空泡明顯減少，移植的細胞生存率提高和行為功能改善，少突膠質細胞分化增加[13]。

誘導多功能干細胞來源的神經干細胞(induced pluripotent stem cell- derived neural stem cells)移植治療脊髓損傷具有治療潛力，通過分化為神經元和神經膠質細胞刺激新組織跨損傷部位。臨床前實驗證明，誘導多功能干細胞來源的神經干細胞移植具有良好的生長、分化情況和治療效果。施旺細胞(schwann cells)移植也是一個有前途的脊髓損傷的治療策略，它已被證明可以減少神經元的丟失、刺激神經元再生、促進髓鞘形成。結合水凝膠移植可以實現施旺細胞的長期生存，并促進血管形成和軸突長入?；|膠Matrigel 和 肽段水凝膠PuraMatrix已經應用于施旺細胞的運輸，促進施旺細胞的生長及運動功能的恢復[14]。

4.2基于分子的策略

脊髓損傷是非常復雜的，細胞分子在組織再生中扮演重要角色，這些細胞分子具有促進血管生成、抑制瘢痕形成、減少炎癥反應、增加神經干/祖細胞存活率等作用。通過水凝膠實現這些細胞分子的局部及持續的運輸，具有廣闊的前景。

硫酸軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC)可以通過降解硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans)降解膠質瘢痕，實現神經元再生和組織修復。硫酸軟骨素蛋白多糖是一種軸突生長抑制因子，可促進膠質瘢痕的形成。硫酸軟骨素酶ABC對熱不穩定， 因此運輸硫酸軟骨素酶ABC到脊髓損傷部位具有挑戰性。Magdalini等設計出一種以親和力為基礎修飾的甲基纖維素(MC)的水凝膠，實現具有生物活性的硫酸軟骨素酶ABC持續釋放。Src同源結構域3(Src homology domain 3，SH- 3)結合肽修飾的MC水凝膠，可以控制通過改變Sp- 蛋白及SH- 3- 多肽的結合力實現硫酸軟骨素酶ABC以可控的速率釋放[15]。

神經營養因子- 3(neurotrophin- 3，NT- 3)可以調節酪氨酸蛋白激酶C 陽性的神經元的存活和功能。有研究人員通過將NT- 3封裝于聚乳酸- 乙醇酸共聚物中分散在一種可注射水凝膠的透明質酸和甲基纖維素，實現持續和局部的釋放[16]。Piantino等設計出一種可注射可降解的水凝膠，實現NT- 3的長期釋放超過2周。水凝膠/ NT- 3處理的動物表現出明顯的軸突生長和功能的改善[5]。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor)治療脊髓損傷是一種很有前途的治療策略。血管內皮生長因子結合水凝膠已應用于脊髓再生的實驗研究，可以增強病變部位及周圍的神經生長。有研究顯示，從可注射的藻酸鹽纖維蛋白原水凝膠局部輸送血管內皮生長因子可以促進血管和神經生長。雖然沒有觀察到功能的恢復，但纖維蛋白原水凝膠被脊髓組織良好地耐受[17]。

膠質細胞源性神經營養因子(glial cell- line- derived neurotrophic factor)是很有前途的細胞分子，因其可以促進多巴胺能的運動及外周感覺神經元的生長。這表明膠質細胞源性神經營養因子具有神經保護作用，促進組織和軸突再生。有研究人員設計一種輸送系統，將膠質細胞源性神經營養因子封裝于微球中從注射藻酸鹽水凝膠中釋放，這種輸送系統可以支持脊髓可塑性和功能恢復[18]。Fon等研究表明裝有膠質細胞源性神經營養因子的可注射明膠基水凝膠可以使神經干/祖細胞從腦室下區(subventricular zone，SVZ)遷移并支持神經干/祖細胞的存活，減少膠質細胞增生[19]。

軸索過度生長抑制因子A(Nogo- A)是髓鞘相關抑制劑，可以通過在病變部位形成不利的環境抑制再生軸突的生長。Nogo- A可以結合Nogo- 66受體(Nogo- 66 receptor，NgR)介導抑制軸突再生[20]。Wei等聯合聚賴氨酸(poly- L- lysine，PLL)修飾的以透明質酸(hyaluronan，HA)為基礎的水凝膠和Nogo- 66受體抗體(Nogo- 66 receptor antibody，anantiNgR)，然后將HA PLL/antiNgR移植到大鼠的脊髓半橫斷模型中,8周后表現出明顯的血管生成和膠質瘢痕的減少[21]。抗Nogo- A(AntiNogo- A)有改善功能恢復的作用，它是一種抗體，不能跨越血腦屏障和血- 腦脊液屏障。Jason等設計出一種運輸系統，由裝有抗軸索過度生長抑制因子A (Anti- NogoA)的聚乳酸- 羥基乙酸共聚物納米微粒分散于透明質酸水凝膠形成。聯合碳酸鎂和碳酸鈣可以實現Anti- NogoA的長期釋放，提高Anti- NogoA的生物活性[22]。有研究顯示生長激素于脊髓損傷后的輸送具有神經保護作用[23]。Sellers等探討凝血酶的輸送實現了神經祖細胞增殖[24]。

總之以水凝膠為基礎的細胞分子輸送系統取得了顯著的進步，但這些分子通過傳統的給藥方式因為血腦屏障和血- 腦脊液屏障受到明顯局限。基于局部釋放的水凝膠可以繞過屏障，提高治療的效率而不破壞這些分子的生物活性。

5結論

脊髓損傷是一個復雜的疾病，常導致神經功能障礙和殘疾，給個人、家庭帶來嚴重負擔[25]。傳統方法無法通過血腦屏障和血- 腦脊液屏障，水凝膠的應用不僅可以給移植細胞提供支持，也可以實現持續和局部細胞分子釋放，調節細胞活動和炎癥反應，促進血管生成，抑制膠質瘢痕形成,在組織工程和再生醫學中已經取得了矚目的成就。但仍有許多我們需要面對的挑戰:試驗表明，移植細胞的存活率需要改進。水凝膠需要進一步修飾，達到對移植細胞的長期支持[26]。有實驗證明腦脊液的流量在分子運輸中起著至關重要的作用，對水凝膠的位置有影響[27]。在未來，基于細胞和分子治療策略需要提高脊髓損傷再生的治療效果，更多的不同的水凝膠的修飾將需要根據不同的條件滿足不同的輸送需求。

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[收稿日期]2015- 10- 18[修回日期] 2016- 01- 30

[作者簡介]馬偉康(1991-)，男，山西洪洞人，在讀碩士研究生。E- mail:4919384897@qq.com

[通信作者]陶樹清E- mail:taoshuqing@aliyun.com

[中圖分類號]R683.2； R681.54

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0460- 04

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03.038

[引文格式] 馬偉康,陶樹清.水凝膠在脊髓損傷修復中的應用[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):460- 463.

·綜述·