血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的條件優化

楊麗梅， 蘇 平， 涂俊銘

(食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北黃石 435002)

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血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的條件優化

楊麗梅， 蘇 平， 涂俊銘*

(食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北黃石 435002)

摘要[目的]探究血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的最佳發酵條件。[方法]先以單因素試驗分析碳源、氮源、轉速、pH、接種量對血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的影響，選取其中3個主要影響因素，采取響應面分析法進一步優化血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的最佳工藝條件。[結果]單因素試驗結果顯示，血芝發酵合成胞內三萜類化合物的最適條件為pH=6，轉速為130 r/min，最適碳源為蔗糖，最適氮源為尿素。響應面法優化的發酵條件為3%接種量、30 g/L蔗糖、1.9 g/L尿素，血芝三萜類化合物含量達16.51 mg/g。[結論]該研究為血芝活性成分的研究提供實際參考依據。

關鍵詞血芝；深層發酵；三萜類化合物；響應面法；優化

皺蓋假芝(Amaurodermarude(Berk.)Torrend)是一種大型靈芝科假芝屬真菌，在培養過程中可以產生血樣分泌物，故又稱為血芝[1]。血芝在臺灣被視為名貴藥材，在防癌方面有奇效[2]。血芝三萜類化合物為血芝的主要活性成分，具有特別明顯的生理活性，已有研究表明，其在抗腫瘤、抗衰老、保肝、降血糖血脂、鎮痛鎮靜等方面有明顯的效果[3-4]。我國血芝資源有限、自然生長周期長等問題嚴重限制了血芝的開發利用。采取液體深層發酵技術收集血芝菌絲體是一種解決和獲取血芝資源的有效途徑[5]。目前，響應面法(RSM)已被廣泛用于生物過程的優化[6-8]，但在血芝液體深層發酵條件研究方面的報道較少[9-11]。該研究先進行單因素試驗，篩選出對血芝三萜類化合物合成影響最大的液體深層發酵因素，再設計響應面分析試驗，進一步優化合成血芝三萜類化合物的發酵條件。

1材料和方法

1.1材料與試劑血芝(皺蓋假芝)，華中農業大學菌種研究中心提供。無水乙醇、高氯酸、冰乙酸、香蘭素、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl等為分析純；可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨等為生化試劑；尿素、豆餅市售。

1.2儀器與設備PCE-3000烘箱，上海索普儀器有限公司；G154DWS全自動高壓滅菌鍋，美國Zealway；雙面紫外超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Specord plus 200紫外可見分光光度計，德國耶拿；DK-8D數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；AB204-N型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UNINAPO 100 EHC真空濃縮干燥器，德國 UNIEQUIP；TDL-60B離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1總三萜含量測定。采用香草醛-高氯酸顯色法[12-13]。

1.3.2熊果酸標準曲線繪制。準確吸取熊果酸標準品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，水浴蒸干，加5%香草醛-冰醋酸0.3 mL、高氯酸1.0 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，以熊果酸的含量(μg)為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線(圖1)，建立回歸方程Y= 0.002 1x- 0.001 5(R2=0.996 3)，表明標準品在0～400 μg范圍內吸光值與熊果酸含量呈良好線性關系。

圖1　三萜類化合物的標準曲線Fig.1 Standard curve of the triterpenoids

1.3.3血芝胞內三萜類化合物提取及測定。稱取0.10 g烘至恒重的血芝菌絲體，加入8 mL無水乙醇，80 ℃水浴3 h，放置室溫，4 000 r/min離心10 min，收集濾液再定容至8 mL，測定提取液中三萜類化合物含量。取0.2 mL待測樣，沸水浴揮去溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL及1.0 mL高氯酸試劑， 60 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，測定OD529 nm吸光值。

1.3.4血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的單因素試驗。

1.3.4.1碳源對合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、2 g/L蛋白胨、20 g/L不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉)、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，接種量2%，在26 ℃，130 r/min培養4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.4.2氮源對合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、20 g/L蔗糖、2 g/L不同氮源(蛋白胨、黃豆粉、酵母粉、氯化銨、尿素)、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，接種量2%，在26 ℃，130 r/min培養4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.4.3轉速和初始pH對合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、2 g/L尿素、20 g/L蔗糖、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，接種量2%，26 ℃，不同轉速(120、130、140、150、160 r/min)培養4 d，測生物量和三萜類化合物含量。調節培養基初始pH(2、4、6、8、自然pH)，在26 ℃，130 r/min培養4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.4.4接種量對合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、2 g/L尿素、20 g/L蔗糖、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，調節pH為6，不同的接種量(1%、2%、3%、5%、10%)，在26 ℃，130 r/min培養4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.5響應面試驗。綜合單因素影響三萜類化合物含量的試驗結果，選擇接種量、碳源、氮源3個主要影響因素，以胞內三萜類化合物含量為響應值，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，采用響應面法在3因素3水平(表1)上對血芝液體深層發酵條件進行優化。

表1　響應面分析因素與水平

2結果與分析

2.1血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的單因素試驗結果

2.1.1碳源對合成血芝三萜類化合物的影響。從圖2可知，蔗糖為碳源時，血芝的胞內三萜類化合物含量最高(13.78 mg/g)，果糖和麥芽糖次之，而大分子物質淀粉的三萜含量最低(10.05 mg/g)。蔗糖也是比較常見的原料，價格比較便宜，所以該試驗中選取蔗糖為合成血芝三萜類化合物的合適碳源。

圖2　不同碳源對血芝生物量和三萜類化合物的影響Fig.2　Effects of carbon sources on the biomass and triterpenoid of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

2.1.2氮源對合成血芝三萜類化合物的影響。圖3表明，在血芝液態發酵過程中，無機氮源相對于有機氮源更有利于血芝菌絲體的生長，這可能與菌絲體能直接吸收利用氨基酸、尿素、銨鹽等小分子化合物有關，且尿素作為氮源時，血芝菌絲體胞內三萜類化合物含量最高，因此選擇尿素作為合成血芝三萜類化合物的最適氮源。

圖3　不同氮源對血芝生物量和三萜類化合物的影響Fig.3　Effect of nitrogen sources on the biomass and triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

2.1.3轉速和初始pH對合成血芝三萜類化合物的影響。從圖4a可看出，隨著轉速升高，生物量增大；轉速太高，反而抑制血芝菌絲體的生長，影響菌球的形成。另一方面，三萜類化合物含量隨著轉速增加而降低，可能是因為血芝三萜類化合物為次級代謝產物，而轉速過高抑制了菌絲體的生長，進而影響次級代謝產物的生成。血芝代謝三萜類化合物總量取決于生物量和胞內三萜類化合物含量2個因素，因此確定最適轉速為130 r/min。

由圖4b可知，初始pH過低或過高均不利于血芝生物量和三萜類化合物含量的增長，在初始pH為6時，生物量達最大(9.35 g/L);在pH為2時，三萜類化合物含量最大，可能因為血芝三萜類化合物為酸性物質，強酸性環境有利于三萜類物質的積累，具體機理有待進一步探究與確認。初步確定合成血芝三萜類化合物的最適初始pH為6。

圖4　轉速(a)和初始pH(b)對生物量和三萜類化合物的影響Fig.4 Effects of rotation speed (a) and initial pH (b) on the triterpenoids

2.1.4接種量對合成血芝三萜類化合物的影響。由圖5可見，血芝菌絲體的生物量和接種量呈正相關。但在接種量>3%時，血芝菌絲球小，不利于三萜類化合物的生成，胞內三萜類化合物含量逐漸降低，因此確定最適接種量為3%。

圖5　接種量對生物量和三萜類化合物的影響Fig.5　Effects of inoculation amount on the biomass and triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

2.2響應面試驗分析以x1=A-2、x2=(B-20)/10、x3=C-2為自變量，以三萜類化合物含量y為響應值，進行響應面試驗。利用Design-expert 8.0.5軟件對表2數據進行回歸擬合分析，對各因素進行回歸擬合后，得到血芝胞內三萜類化合物含量對接種量、碳源和氮源的二次多項回歸方程為：Y=11.94+2.02x1+1.06x2-0.059x3+0.92x1x2-0.38x1x3+0.24x2x3+0.47x12-0.039x22-0.73x32。經分析，該二次多項模型具有高度顯著性(P=0.005 7<0.01)；失擬項P=0.000 7，表示有0.07%的概率使得模型偏差由噪音產生，因此模型失擬項不顯著；模型的擬合度R2為0.912 7，說明模型擬合程度好。該結果表明可以用此模型對血芝液態發酵合成三萜類化合物的條件進行分析和預測。

由利用Design-expert 8.0.5軟件做出的以三萜類化合物含量為響應值的響應面和等高線(圖6~8)可知，血芝胞內三萜類化合物代謝的優化條件為接種量3%、蔗糖30 g/L、尿素1.9 g/L，在此條件下，三萜類化合物含量的預測值為16.40 mg/g。

為了驗證響應面試驗的可靠性，采用優化的血芝液體深層發酵條件(3%接種量、30 g/L蔗糖、1.9 g/L尿素)，在26 ℃、130 r/min條件下培養4 d的血芝胞內三萜類化合物含量為16.51 mg/g，實際測量值與理論預測值(16.40 mg/g)接近，無顯著性差異。該試驗結果表明采用響應面分析法優化的血芝三萜類化合物發酵條件可行。

表2　響應面方案及試驗結果

圖6　接種量和碳源對三萜類化合物影響的響應曲面(a)和等高線(b)Fig.6　Response surface (a) and contour line (b) of the effects of inoculation amount and carbon source on the triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

圖7　接種量和氮源對三萜類化合物影響的響應曲面(a)和等高線(b)Fig.7　Response surface and contour line of the effects of inoculation amount and nitrogen source on the triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

圖8　氮源和碳源對三萜類化合物影響的響應曲面(a)和等高線(b)Fig.8　Response surface and contour of the effects of carbon and nitrogen sources on the triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

3結論與討論

該研究先以單因素試驗分析碳源、氮源、轉速、pH、接種量對血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的影響，選取其中3個主要影響因素，采取響應面分析法進一步優化血芝液體深層發酵合成三萜類化合物的最佳工藝條件。經試驗綜合確定了以土豆汁為基礎培養基時，血芝液體深層發酵的最適碳源為蔗糖，最適氮源為尿素，最適接種量、pH和轉速分別為3%、6及130 r/min。用響應面分析進一步優化得到發酵的最優組合為接種量3%、蔗糖30 g/L、尿素1.9 g/L，在此條件下培養的血芝菌絲體生長良好，胞內三萜類化合物含量為16.51 mg/g，比理論值(16.40 mg/g)大，不排除其他發酵因素影響。

對比其他研究發現，血芝的菌絲體發酵條件與靈芝科大多數菌種發酵條件有很高的相似性，可以相互借鑒[14-15]。而在三萜類化合物發酵條件上存在差異，如碳源和接種量有明顯的不同，南韓靈芝的最適氮源和碳源為豆粕和淀粉，接種量20%[15]，具體原因有待于進一步研究。

響應面試驗優化后的結果對比單因素試驗的結果有很明顯的優化，且最大胞內三萜類化合物含量達鄭林用等[11]研究得出結論的1.44倍。可見，響應面分析方法在對血芝三萜類化合物的發酵研究上是有效的，預計在血芝其他活性成分的研究上也將有一定的實際參考價值。

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Optimization of Triterpenoids Production by Liquid Submerged Fermentation ofAmaurodermarude(Berk.)Torrend

YANG Li-mei,SU Ping,TU Jun-ming*(Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation & Utilization,Huangshi,Hubei 435002)

Abstract[Objective] To study the best production conditions of triterpenoids by liquid submerged fermentation ofAmaurodermarude(Berk.) Torrend. [Methods] Firstly, single factor experiment was carried to analyze the effects of carbon source, nitrogen source, rotational speed, pH and inoculation amount on the triterpenoids production by liquid submerged fermentation ofAmaurodermarude(Berk.) Torrend. Then, three major factors were selected. Finally, the Response Surface Methodology (RSM) was applied to further optimize the best production conditions of triterpenoids by liquid submerged fermentation ofAmaurodermarude(Berk.) Torrend. [Results] Single factor experiment indicated that the best production conditions were as follows: pH = 6; the rotational speed was 130 r/min; the optimum carbon source was sucrose; the optimum nitrogen was urea.The fermentation conditions optimized by RSM were 3% inoculation amount, 30 g/L sucrose, 1.9 g/L urea; in these conditions, the triterpenoids production ofAmaurodermarude(Berk.)Torrend reached 16.51 mg/g. [Conclusion] The study provides the practical reference basis for the study of the active ingredients ofAmaurodermarude(Berk.)Torrend.

Key WordsAmaurodermarude(Berk.) Torrend; Submerged fermentation; Triterpenoids; Response Surface Methodology (RSM); Optimization

收稿日期2015-12-21

作者簡介楊麗梅(1990-)，女，湖北黃石人，碩士研究生，研究方向：微生物學。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事微生物工程研究。

基金項目食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室開放基金(EWPL201511)。

中圖分類號S 567.3+1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-158-04