miR-203a-3p通過SLUG調控上皮間質化抑制肝癌細胞的遷移及侵襲

張國柄 徐江海 王東風

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，手術切除后仍有較高的復發率與轉移率，嚴重威脅患者生存。研究表明，上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肝癌的侵襲轉移過程中發揮重要作用，可導致細胞間喪失粘連，細胞遷移、外滲，最終表現為腫瘤的轉移[1-3]。MicroRNA是小型非編碼RNA，可抑制或中斷靶基因的轉錄后表達。Qian等[4]研究報道，與相鄰的正常組織相比，結直腸癌組織中miR-203a-3p的表達明顯下調，過表達miR-203a-3p可抑制人結直腸癌細胞的侵襲和遷移，促進癌細胞凋亡，提示miR-203a-3p具有抑癌作用。本研究的前期研究發現，相比于正常組織和細胞，miR-203a-3p在肝癌組織和細胞中存在異常低表達。因此，本研究通過體外細胞實驗，探究miR-203a-3p對肝癌細胞遷移和侵襲的影響，以期為肝癌的靶點治療提供有力的實驗依據。

資料與方法

一、實驗材料和儀器

人肝癌細胞HepG2，上海ATCC細胞庫；4～5周齡雄性BALB/c-Nude裸鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司；Transwell小室，美國Costar公司；TRIzol試劑，美國Invitrogen公司；全蛋白提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；小鼠抗人SLUG抗體、小鼠抗人E-cadherin抗體、小鼠抗人Occludin抗體、小鼠抗人N-cadherin抗體、小鼠抗人Vimentin抗體、兔抗小鼠IgG(HRP)抗體，艾博抗(上海)貿易有限公司。

生物安全柜，美國Advantage公司；低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；細胞培養箱、酶標儀，美國Thermo公司；qRT-PCR儀，美國Life公司；轉膜儀、電泳儀，美國Bio-Rad公司。

二、實驗方法

(一)細胞轉染 將培養至對數生長期的HepG2細胞用胰酶消化3 min，加入適量細胞培養基后使用移液器輕柔吹打，收集細胞于離心管離心10 min，條件為4 ℃、1 500 r/min，細胞再經無菌PBS洗滌2次，加入細胞培養基將細胞重懸為5×104/mL的單細胞懸液，于6孔培養板中接種2 mL。將細胞分為對照組、miRNA-NC組和miR-203a-3p組，培養至80 %融合率時，使用轉染試劑將陰性對照序列或miR-203a-3p mimic轉染入HepG2細胞中，作為miRNA-NC組和miR-203a-3p組，將未轉染的HepG2細胞作為對照組，細胞培養箱中繼續培養48 h。

(二)Transwell侵襲實驗 Transwell上室加入基質膠后在37 ℃恒溫箱中孵育過夜，用于檢測細胞侵襲。經1.2.1處理的細胞用胰酶消化后，培養基重懸，密度調整為2×105/mL。取100 μL細胞懸液加入到上室，取500 μL 10 % FBS細胞培養基加入到下室，置于37 ℃、5 % CO2培養箱中孵育24 h。將小室膜小心取出，用無菌棉簽輕輕擦去上室面細胞，對下室面細胞進行固定和結晶紫染色，光鏡下觀察、計數。

(三)細胞劃痕實驗 取處理過的各組細胞，棄上層培養基，使用無菌的200 μL槍頭垂直劃過板底的細胞層，形成可見劃痕，然后滴加無菌PBS，洗滌去除多余的細胞碎片，隨后在光鏡下拍照，結果記錄為0 h。將細胞繼續培養24 h后，光鏡下拍照，結果記錄為24 h。采用Image Pro Plus 6.0分析0 h和24 h的劃痕面積，計算劃痕愈合率=[(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積]×100%。

(四)雙熒光素酶實驗 通過(http://www.targetscan.org/vert_72/)TargetScan網站，在線預測miR-203a-3p靶基因，選定SLUG進行驗證。實驗分為：pMIR-SLUG-WT+miR-203a-3p mimics組、pMIR-SLUG-WT+miRNA-NC組、pMIR-SLUG-MUT+miR-203a-3p組、pMIR-SLUG-MUT+miRNA-NC組，進行細胞轉染24 h后，使用雙熒光素酶檢測試劑盒對各組細胞的熒光強度進行檢測。

(五)qRT-PCR 提取培養的各組細胞總RNA，根據說明書合成cDNA，隨后進行qRT-PCR，將U6和GAPDH設置為內參，2-ΔΔCt法處理數據。miR-203a-3p上游引物：5′-CCG CTC GTG AAA TGT TTA GG-3′，下游引物：5′-CAG AGC AGG GTC CGA GGT A-3′；SLUG上游引物：5′-GCA ATA AGA CCT ATT CAA C-3′，下游引物：5′-ATA TTC CTT GTC ACA GTA TT-3′；U6上游引物：5′-CGC TTC GGC AGC ACA TAT AC -3′，下游引物：5′-TTC ACG AAT TTG CGT GTC ATC-3′；GAPDH上游引物：5′-CTC TGG TAA AGT GGA TAT TGT-3′，下游引物：5′-GGT GGA ATC ATA TTG GAA CA-3′。

(六)WB 取培養的各組細胞，胰酶消化收集細胞，根據全蛋白提取試劑盒說明書操作，提取各組細胞總蛋白，經蛋白定量后，取50 mg進行電泳。電泳結束后取出凝膠，使用轉膜儀進行PVDF轉膜，結束后取PVDF膜浸于5 %脫脂奶溶液中，室溫封閉1 h；4 ℃搖床中稀釋一抗(1∶1 000稀釋的SLUG抗體、E-cadherin抗體、Occludin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體)孵育過夜；洗滌，室溫搖床中稀釋二抗(1∶2 000稀釋的兔抗小鼠IgG抗體)孵育1 h；洗膜、顯色、成像系統拍照，Image J軟件分析結果圖像。

(七)裸鼠移植瘤實驗 取培養的各組細胞，胰酶消化后制成5×106/mL的單細胞懸液，于裸鼠右側腋窩皮下注射200 μL，記為對照組、miRNA-NC組和miR-203a-3p組，每組注射6只裸鼠。接種后密切關注裸鼠狀況，每3 d游標卡尺測量1次瘤體直徑，共30 d，計算腫瘤體積=(短徑2×長徑)/2。

三、統計學分析

結 果

一、miR-203a-3p對HepG2細胞侵襲和遷移能力的影響

與對照組細胞侵襲數[(71.53±6.21)個]相比，miRNA-NC組[(66.47±6.59)個]差異無統計學意義(P>0.05)，miR-203a-3p組[(34.71±4.56)個]顯著降低(P<0.05)(F=69.757,P=0.000)。與對照組劃痕愈合率[(63.98±6.18)%]相比，miRNA-NC組[(59.61±5.34)%]差異無統計學意義(P>0.05)，miR-203a-3p組[(27.79±3.56)%]顯著降低(P<0.05)(F=88.484,P=0.000)(圖1)。

二、miR-203a-3p與SLUG的靶向關系

miR-203a-3p與SLUG存在靶向關系(圖2)。與pMIR-SLUG-WT+miRNA-NC組熒光素酶活性(1.03±0.02)相比，pMIR-SLUG-WT+miR-203a-3p mimics組(0.39±0.04)明顯下降(P<0.05)；pMIR-SLUG-WT+miRNA-NC組、pMIR-SLUG-MUT+miRNA-NC組(0.97±0.06)、pMIR-SLUG-MUT+miR-203a-3p組(1.01±0.05)之間差異無統計學意義(P>0.05)(F=280.493,P=0.000)。

圖2 預測靶向圖(SNAI2即為SLUG)

三、miR-203a-3p對HepG2細胞中miR-203a-3p表達以及SLUG mRNA、蛋白表達的影響

如表3、圖3所示，與對照組相比，miRNA-NC組miR-203a-3p、SLUG mRNA和蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，miR-203a-3p組miR-203a-3p的表達顯著升高，SLUG mRNA和蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。

圖3 WB檢測各組細胞SLUG蛋白的表達

表3 各組細胞miR-203a-3p的表達以及SLUG mRNA和蛋白的表達比較(±s, n=6)

四、miR-203a-3p對HepG2細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響

如表4、圖4所示，與對照組相比，miRNA-NC組E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，miR-203a-3p組E-cadherin、Occludin蛋白表達顯著升高，N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

表4 miR-203a-3p對各組細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響(±s, n=6)

圖4 WB檢測各組細胞中上皮間質轉化相關蛋白的表達

五、miR-203a-3p對裸鼠種植瘤體積增長的影響

如圖5所示，隨著時間的推移，對照組裸鼠腫瘤體積不斷增大，miRNA-NC組裸鼠腫瘤生長基本對照組同步，miR-203a-3p組裸鼠腫瘤生長相較于對照組受到明顯抑制。

圖5 miR-203a-3p對裸鼠種植瘤體積增長的影響

討 論

肝癌在我國是高發惡性腫瘤，手術切除腫瘤組織后，如何有效預防和治療其復發和轉移，是當前肝癌治療的難點和熱點。多個報道認為，E-cadherin和Occludin蛋白表達的缺失與細胞運動性增加和癌癥晚期轉移有關[5-8]，N-cadherin和Vimentin蛋白在腫瘤中高表達，與實體惡性腫瘤侵襲增強有關[9-10]。近年來研究發現，miRNA與腫瘤的發生發展關系密切[11]。Wang等[12]研究表明，miR-203a-3p在胃癌組織和細胞系中的表達均下調，體外過表達miR-203a-3p可降低胃癌細胞的增殖和細胞周期進展。在本研究中，相較于對照組，miR-203a-3p轉染組的E-cadherin、Occludin蛋白表達明顯升高，N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯降低，細胞侵襲和遷移能力也明顯降低，提示miR-203a-3p可能通過下調EMT相關蛋白的表達，抑制肝癌細胞的侵襲和遷移。

多個研究報道，SLUG是一個重要的E-cadherin抑制因子，可誘導EMT的發生[13-14]。Rahimian等[15]研究發現，下調SLUG基因表達可使三陰性乳腺癌細胞EMT過程受到抑制并且癌細胞侵襲性明顯降低。本研究結果顯示，SLUG是miR-203a-3p的靶基因，推測miR-203a-3p可能通過靶向調控SLUG表達來抑制EMT過程。

綜上所述，miR-203a-3p可能靶向抑制SLUG表達，上調E-cadherin、Occludin蛋白表達，下調N-cadherin、Vimentin蛋白表達，抑制EMT過程，進而抑制肝癌細胞的侵襲和遷移，本研究結果可為肝癌的靶點治療提供一定實驗依據。