Gao-Binge酒精性肝病模型小鼠的損傷特點

周梅月 全卉 陳賀寧 江宇泳

酒精性肝病(ALD)是全球肝病的主要類型,中國ALD的發病率也正在迅速增加[1-2]。越來越多的證據表明腸-肝軸機制是導致ALD的重要機制之一[3]。其以腸道通透性增加為形式的腸屏障功能障礙促進內毒素進入肝臟，觸發了肝臟炎癥的促炎級聯反應[4-6]。此外，臨床研究表明酒精依賴性受試者的腸道通透性增加主要局限于小腸，并且長期飲酒會導致血液中內毒素水平升高[7-8]。這些研究都證明了ALD的發生與腸屏障功能損傷、內毒素水平升高關系密切。本文通過微調Gao-Binge ALD小鼠模型，檢測ALD模型小鼠血漿ALT、AST、內毒素水平，觀察肝臟、小腸病理改變等，驗證Gao-Binge ALD模型小鼠的損傷特點，為ALD模型的選擇提供借鑒，并為“從腸治肝”的研究提供理論依據。

材料與方法

一、實驗動物

20只C57BL/6N雄性小鼠，SPF級，(20±2) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物許可證號：SCXK(京)2016-0006；合格證號：110011200107412545；飼養地：北京中醫藥大學東直門醫院屏障環境動物實驗室。

二、主要試劑

Lieber-DeCarli對照液體飲食、Lieber-DeCarli酒精液體飲食、麥芽糖糊精均購自Bio-Serv公司；無水乙醇購自北京化工廠；AST、ALT檢測試劑盒購自富士膠片和光純耀化學有限公司；內毒素檢測試劑盒購自湛江安度斯生物有限公司；Occludin抗體、Zo-1抗體購自ABCAM公司；HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP-山羊抗兔IgG(H+L)購自Jackson公司; BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Cwbiotech公司；彩色預染蛋白分子量標準購自碧云天生物公司。

三、主要檢測儀器

全自動生化分析儀(日本日立公司)，病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)，正置光學顯微鏡(日本尼康)，成像系統(日本尼康)，動態試管檢測儀(湛江安度斯生物有限公司)。

四、動物分組與模型建立

適應性喂養一周后，將小鼠隨機分為正常組和模型組，每組10只。ALD小鼠模型的制備：參考文獻[9]并根據多次實驗結果，調整制備ALD模型的喂食量以保證不同組別小鼠飲食熱量相同(表1)：模型組小鼠首先使用Lieber-DeCarli對照液體飲食喂養5 d，然后使用含酒精的Lieber-DeCarli液體飲食喂養10 d，第16天清晨對模型組小鼠進行一次大劑量酒精(5 g/kg)灌胃。正常組小鼠造模期間給予對照液體飲食，并且保證與模型組小鼠等熱量喂養。第16天清晨對正常組小鼠進行一次大劑量麥芽糖糊精(9 g/kg)灌胃。灌胃9 h后，眼球取血，頸椎脫位處死小鼠，并保留肝臟、小腸和外周血標本。

表1 造模方法

五、測定指標及方法

(一)肝臟指數與組織病理學檢查 每日稱量小鼠體質量，取材時，分離完整新鮮肝臟后稱重，計算肝臟指數=肝臟濕重/體質量×100%。4%多聚甲醛固定肝組織和小腸組織后，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟和小腸病理變化。

(二)血漿生化指標檢測 小鼠眼球取血后，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min后，分離得到血漿，使用全自動生化分析儀檢測小鼠血漿中AST、ALT活性，使用動態試管檢測儀通過光度測定法檢測血漿內毒素水平。

(三)Western Blot 檢測 小腸組織勻漿后，12 000 g離心15 min，取上清，進行蛋白定量。配膠，上樣，電泳，轉膜，封閉，分別在4 ℃冰箱孵育Zo-1、Occludin、β-actin一抗過夜。次日洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影，拍照。

六、統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料均以均值±標準差表示，兩組計量資料均符合正態時，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗分析，若有一組計量資料不符合正態分布，則采用非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠一般情況及血生化指標比較

模型組小鼠與正常組小鼠造模前初始體質量和造模后最終體質量，兩組比較均沒有統計學差異(P均>0.05)，保證了造模過程中兩組小鼠等熱量喂養。模型組小鼠的肝臟指數較正常組小鼠肝臟指數顯著增加(P<0.05)。與正常組相比，模型組小鼠血漿ALT、AST、內毒素水平均顯著增高(P均<0.01)(表2)。

表2 小鼠一般情況、血生化指標比較

二、小鼠肝臟和小腸組織病理檢查

肝臟組織HE染色結果顯示：正常組小鼠肝細胞胞質較豐富，嗜酸性染色，細胞核圓并且清晰，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列整齊，無明顯病變。模型組小鼠肝細胞排列紊亂，細胞界限模糊不清，大量肝細胞內出現大而融合脂滴，將核擠向一側類似脂肪細胞，部分肝細胞核發生混濁腫脹，肝小葉結構不清，出現炎性細胞浸潤。

小腸組織HE染色結果顯示：正常組小鼠小腸的腺體排列整齊，上皮完整，黏膜正常，無明顯病變。模型組小鼠小腸組織形態紊亂，部分腺體壞死脫落，甚至斷裂，絨毛破損，上皮細胞和杯狀細胞丟失減少，炎性細胞浸潤，腸內血管擴張充血(圖1)。

A：正常小鼠肝臟病理，×20；B：模型小鼠肝臟病理，×20；C：正常小鼠小腸病理，×20；D：模型小鼠小腸病理，×20

三、Western Blot 檢測小腸組織緊密連接蛋白Zo-1和Occludin的表達情況

與正常組相比，模型組小鼠緊密連接蛋白Zo-1(P<0.05)和Occludin(P<0.01)的表達水平顯著降低(圖2)。

1、2分別為正常組、模型組

討 論

動物實驗研究可以提供一種更好的了解ALD發病機制的方法。但是，許多ALD動物模型之間差異較大，并非所有模型都能完全模擬人類ALD[10]。值得重視的是，在長期過量飲酒的人群中，約95%會出現肝臟脂肪變性，35%可逐漸發展為酒精性肝炎、肝纖維化甚至肝癌[11]。因此，建立和區分ALD不同階段的動物模型對研究的準確性十分重要。

本研究通過多次實驗得出結論，需調整小鼠喂食量以保證不同組別小鼠飲食熱量相同。其中，模型組與正常組小鼠初始體質量和最終體質量均沒有顯著差異，說明造模過程中保證了兩組小鼠之間等熱量攝入，避免了因飲食攝入量不同造成的差異。同時本研究結果顯示，模型組小鼠血生化指標AST、ALT顯著升高，肝臟病理出現大量脂肪變和存在炎性細胞浸潤。這表明Gao-Binge ALD模型與人類酒精性肝炎較為相似，為Gao-Binge ALD模型用于酒精性肝炎的研究使用提供了理論依據。另外，本實驗結果顯示小鼠血液中內毒素水平顯著升高，小腸HE染色出現組織形態紊亂，絨毛破損，上皮細胞和杯狀細胞丟失減少，炎性細胞浸潤等病理改變，小腸組織中緊密連接蛋白Zo-1和Occludin的表達顯著降低。這些數據證實了Gao-Binge ALD模型時小鼠肝臟發生損傷，同時腸道屏障功能被破壞，內毒素水平升高，驗證了ALD的“腸-肝軸”理論[12-13]。尤其是小腸HE染色顯示杯狀細胞減少從病理角度驗證了前人的研究成果：腸上皮中的杯狀細胞產生保護性三葉因子和黏蛋白，對腸道屏障功能有保護作用[14]。另外很重要的是，構建Gao-Binge ALD模型時可通過添加輔劑模擬其他危險因素合并酒精性肝損傷，為探索ALD的危險因素或探究其他疾病與ALD之間的共同作用提供了很大便利[15]。

綜上，腸道來源的內毒素等有害物質誘發肝臟炎癥在ALD的發病和進展中發揮重要作用，但ALD治療仍然是臨床難點。選擇合適的動物模型探討ALD的發病機制和有效治療方法意義重大。本研究觀察了Gao-Binge ALD模型小鼠的腸道、肝臟組織損傷，血漿內毒素水平升高，為從“腸-肝軸”研究ALD動物模型的選擇提供了理論支持，也為從腸治肝，提供了理論依據。然而Gao-Binge ALD模型亦存在一定的局限性，不能造成小鼠酒精性肝硬化的發生，對于酒精性肝硬化的研究，應另選其他經典模型。