金銀花與山銀花指紋圖譜對比

黃海燕 饒偉文 鐘建理

·實驗研究·

金銀花與山銀花指紋圖譜對比

黃海燕 饒偉文 鐘建理

本文通過指紋圖譜比較金銀花和山銀花的質量。參照《中國藥典》2015年版收載的含量測定的方法建立兩個系統的指紋圖譜,對50批樣品進行指紋圖譜分析。木犀草苷分析系統下的金銀花(忍冬)和山銀花指紋圖譜相似度高,皂苷分析系統下的指紋圖譜不同品種間相似度低。木犀草苷分析系統說明金銀花與山銀花有共同的有效成分物質基礎,本系統指紋圖譜不能區別具體品種。皂苷分析系統中不同品種的指紋圖譜有較明顯的區別,可用于金銀花與山銀花具體品種的鑒別參考。金銀花與山銀花所含主要成分有相似,也有差異,建議湯劑配方、口服或外用的中成藥,金銀花與山銀花均可通用,而中成藥注射劑應使用金銀花,且使用前應做皂苷限度檢查。

金銀花；山銀花；主要成分；指紋圖譜

金銀花和山銀花是清熱解毒的常用中藥。《中國藥典》2005年版開始,將金銀花和山銀花分列,金銀花以綠原酸、木犀草苷為定量指標,山銀花以綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙的總量為定量指標。何兵、熊艷、張芳等［1-3］建立了金銀花或山銀花指紋圖譜并進行質量分析。但實驗樣品批次較少,產地較單一,4種山銀花的品種僅收集到灰氈毛忍冬1種,品種代表性不夠,對金銀花和不同品種山銀花的質量評價結果說服力不足。為了進一步比較金銀花和山銀花的質量,指導臨床和生產的合理應用,本文采集或收集50批不同產地金銀花、山銀花,參照《中國藥典》2015版金銀花和山銀花項下收載的含測方法［4］,分別測定相關成分的含量,同時通過兩個液相色譜系統,進行指紋圖譜對比,現將指紋圖譜研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1儀器 waters 2695/2998/2487 液相色譜儀,Alltech 3300 ELSD檢測器,XS205DU梅特勒電子分析天平,KQ-600E型超聲儀,SIGMA 3-30K高速臺式冷凍離心機,Lab Tech EV311旋轉蒸發儀。

1.2材料

1.2.1木犀草苷照品(批號：111720-201307),綠原酸對照品(批號：110753-201314),異綠原酸 A(3,5-二咖啡酰奎寧酸)對照品(批號：111782-201405),異綠原酸 C(4,5-二咖啡酰奎寧酸)對照品(批號：111894-201102),灰氈毛忍冬皂苷乙對照品(批號：111814-201303),川續斷皂苷乙對照品(批號：111813-201202),均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸、冰醋酸為色譜純,其余試劑均為分析純,水為高純水。

1.2.2金銀花19批、灰氈毛忍冬12批、紅腺忍冬15批、黃褐毛忍冬3批和華南忍冬1批,均系本所采集或收集,并由饒偉文主任藥師對其植物品種進行了鑒定,金銀花為忍冬Lonicera japonica Thunb.,灰氈毛忍冬為Lonicera macranthoides Hand.一Mazz.,紅腺忍冬為Lonicera hypoglauca Miq.,華南忍冬為Lonicera confusa DC.,黃褐毛忍冬為Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng。

2方法與結果

2.1木犀草苷分析系統

2.1.1溶液的配制

2.1.1.1對照品溶液 精密稱取木犀草苷、綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C 對照品適量,分別置50 ml容量瓶中,用70%乙醇溶解并稀釋至刻度,制成每1 ml各含40 μg的對照品溶液。

2.1.1.2供試品溶液 取本品細粉(過4號篩)約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50 ml,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率35 kHz)1 h,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續濾液10 ml,回收溶劑至干,殘渣用70%乙醇溶解并轉移至5 ml量瓶中,加70%乙醇至刻度,即得。

2.1.2色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6× 250 mm,5 μm；流動相：乙腈為流動相A,0.5%冰醋酸為流動相B,梯度洗脫程序見表1；流速1.0 ml/min；檢測波長：350 nm；柱溫：30.0℃；進樣10 μl。分別取對照品溶液、供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖。見圖1。

表1 木犀草苷分析系統梯度洗脫程序

圖1 木犀草苷分析系統的HPLC圖

2.1.3測定結果 木犀草苷分析系統中,金銀花和山銀花共50批樣品色譜圖均相似,峰3為木犀草苷,另外所有樣品均檢測到的3個較大的色譜峰經對照品保留時間和紫外吸收圖比對,鑒定為綠原酸、異綠原酸A(3,5-二咖啡酰奎寧酸)和異綠原酸C(4,5-二咖啡酰奎寧酸)。將色譜圖以AIA格式輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.130723版本)”。以金銀花1號樣品為參照圖譜,采用中位圖譜生成方式,時間寬度為0.5,分別對所有樣品的色譜信息進行相似度評價分析,結果相似度均＞0.99,表明金銀花和各品種山銀花在這個液相系統檢測到的化學成分相對一致,但本系統指紋圖譜不能區別具體品種。

2.2皂苷分析系統

2.2.1溶液的配制

2.2.1.1對照品溶液 精密稱取綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙對照品適量,分別置25 ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成每1毫升各含200 μg的對照品溶液。

2.2.1.2供試品溶液 取樣品粉末(過4號篩),取約0.3 g,精密稱定,精密稱定,置50 ml 離心管中,加50%甲醇40 ml并混勻,超聲處理40 min(功率250 W,頻率35 kHz),離心10 min (5000轉/min),取上清液轉移至50 ml量瓶中,殘渣加50%甲醇7 ml渦旋1 min,離心10 min(5000轉/min),合并上清液至同一量瓶中,加50%甲醇至刻度,混勻,以0.45 μm微孔濾膜濾過,即得。

2.2.2色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18 4.6×250 mm,5 μm；流動相：0.4%甲酸為流動相A,乙腈為流動相B,梯度洗脫程序見表2；流速1.0 ml/min；柱溫：30.0℃；進樣10 μl；蒸發光散射檢測器(ELSD)漂移管溫度：60℃,氣體流量：2.0 L/min。分別取對照品溶液、供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖。見圖2。

表2 皂苷分析系統梯度洗脫程序

圖2 皂苷分析系統的HPLC圖

2.2.3測定結果 皂苷分析系統中,山銀花的相同品種的樣品之間色譜圖較相似,重復性好；19批金銀花(忍冬)大部分也較一致,未檢出川續斷皂苷乙和灰氈毛忍冬皂苷乙,但有7批檢出川續斷皂苷乙峰,其中3批同時檢出灰氈毛忍冬皂苷乙峰。

品種之間色譜圖有差異,灰氈毛忍冬和紅腺忍冬色譜圖相對其他品種較接近,只峰面積比不同,灰氈毛忍冬的灰氈毛忍冬皂苷乙峰明顯大于川續斷皂苷乙峰,而紅腺忍冬的灰氈毛忍冬皂苷乙峰小于川續斷皂苷乙。金銀花(忍冬)色譜圖在兩個皂苷峰保留時間附近幾乎沒有色譜峰。

將色譜圖以AIA格式輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.130723版本)”,采用中位圖譜生成方式,時間寬度為0.5,分別對所有樣品的色譜信息進行相似度評價分析,結果灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬相同品種之間相似度較高,不同品種之間的相似度則較低。表明金銀花和各品種山銀花在這個液相系統檢測到的化學成分有差異。特別是皂苷部分,品種之間的皂苷成分的種類和含量不同。用系統的指紋圖譜可用于金銀花與山銀花具體品種的鑒別。

3 討論

由于中藥化學成分的復雜性,普遍存在多組分共存、多種藥理作用綜合起效的情況。有文獻報道金銀花和山銀花的藥理作用相同,均有抗菌、抗病毒、退熱和抗炎等作用,不論是金銀花還是山銀花都可以有效地抑制鏈球菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、綠膿桿菌等病菌［5,6］；亦有研究報道,雖然灰氈毛忍冬和忍冬的幾種有效成分含量存在較大差異,但它們對6種常見致病菌均有明顯地抑菌和殺菌作用,而且在抗菌、抗炎、解熱、免疫調節等方面,灰氈毛忍冬與忍冬的作用相當［7］。中國藥典的金銀花和山銀花兩個品種的性味歸經、功能主治、用法用量亦完全相同,臨床應用無法區分。鑒于山銀花含皂苷總體偏高的情況,本文為了充分利用中藥資源,湯劑配方、口服或外用的中成藥,金銀花與山銀花可通用,但中成藥注射劑應使用金銀花,而且投料前應先做皂苷限量檢查,以保證用藥安全。

［1］何兵,劉艷,李春紅,等.多指標定量指紋圖譜在中藥金銀花質量評價中的應用.中國藥學雜志,2015,50(14):1237-1242.

［2］熊艷,高慧敏,王智民,等.金銀花不同干燥技術HPLC指紋圖譜研究.中國中藥雜志,2009,34(8):1015-1017.

［3］張芳,孫希芳,張永清,等.金銀花藥材的HPLC指紋圖譜及綠原酸、木犀草苷含量的同時測定.四川農業大學學報,2014,32(2):154-159.

［4］魏惠珍,羅小妹,劉文霞,等.2015版《中國藥典》一部增修訂概況.江西中醫藥大學學報,2016,28(4):221.

［5］胡克杰,孫考祥,王曙璐,等.氯原酸體外抗病毒作用研究.哈爾濱醫科大學學報,2001,35(6):430-432.

［6］李光玉,吳如英,王玉英,等.灰氈毛忍冬的質量研究(IV)—對普通感冒的臨床療效觀察.中藥材科技,1984(3):14.

［7］張小娜,唐清,侯敏,等.灰氈毛忍冬與忍冬的藥理作用比較研究.中國藥理學通報,2012,28(11):1582-1587.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.16.203

2016-05-19］

541001 廣西桂林食品藥品檢驗所