母體血清MicroRNAs可作為胎兒先天性心臟病產前檢查的非侵入性生物標記物

朱莎莎

母體血清MicroRNAs可作為胎兒先天性心臟病產前檢查的非侵入性生物標記物

朱莎莎

目的先天性心臟病是胚胎發育過程中最常見的畸形。本次研究的目的就在于檢測母體中血清miRNAs的含量，以及它們與胎兒先天性心臟病的關系。方法提取孕18～22周時的母體血清總RNA，而后運用SOLiD測序和熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）的方法檢測母體血清中miRNAs的相對表達量，應用統計學方法計算其靈敏性和特異性。結果發現miR-19b, miR-22，miR-29c和miR-375這4種miRNAs在懷有先天性心臟病胎兒的母體血清中表達顯著升高，并且它們作為標記物的曲線下面積（AUC）分別是0.790，0.671，0.767和0.693，能有效發現胎兒先天性心臟病。結論筆者發現并證實了有4種血清miRNAs可以作為胎兒先天性心臟病產前檢查的一種關鍵性的非侵入性生物標記物。

母體血清miRNAs；生物標記物；先天性心臟病

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是指心臟和胸內大血管的結構畸形及其可能導致的功能性異常，是胎兒及新生兒缺陷中最常見的一種。每年約有8‰的新生兒患有CHD[1]，死于CHD的新生兒占新生兒總死亡率的40%，其中20%死于出生后第1個月[2]。因此，早期診斷是減少CHD發病率和死亡率的關鍵。

miRNA一類生物體內自然生成的小分子非編碼RNA，其成熟狀態長約19～23個核苷酸，具有高度保守性、含量豐富、結構穩定、易于定量檢測、疾病高特異性等特點[3]。最新數據顯示心臟組織有其特異性的miRNAs，即這些miRNAs的表達水平與相同組織的正常細胞存在顯著差異[4]。有研究表明，心臟源特異的miRNAs和胎盤miRNA的表達呈正相關，且這些胎盤源的miRNA可在母親外周血中被檢測到[5]。

因此我們假設，在孕早期時，我們可以通過檢測母體血清中的miRNAs表達來篩查胎兒CHD。首先通過SOLiD測序的方法系統篩查出先天性心臟病胎兒特異表達的miRNAs，而后通過熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）進行驗證。

1 材料和方法

1.1 研究設計和樣本特點

2015年7月～2016年8月，本研究在蘇州大學附屬第一醫院總共收集了98例病例。其中38例病例因既往有心臟病病史、有心臟病家族史、妊娠期并發癥以及多胎妊娠或者胎兒患有唐氏綜合征等易導致CHD的疾病等因素被剔除。最終納入60例符合標準的樣本，其中病例組為30例懷有CHD胎兒的母體血清，對照組為30例懷有正常胎兒的母體血清。病例組中胎兒CHD都是通過胎兒心超證實的，30例CHD主要包括室間隔缺損、房間隔缺損和法洛四聯癥。為了減少影響因素，筆者還匹配了孕婦的年齡和孕周。使用t檢驗可得，病例組平均年齡（27.74±4.68）歲，平均孕周（20.99±1.29）周，而對照組平均年齡（28.48±1.29）歲，平均孕周（20.20±1.09）周，P＞0.05，兩組間差異無統計學意義。本次研究由蘇州大學以及蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會批準，每個樣本的臨床信息都來源于產檢報告，并在納入前得到了參與者的同意。

1.2 血清準備和RNA提取

在孕18～22周時采集5 ml母體靜脈血。全血在室溫靜置30 min后，以4 000轉/min的轉速離心10 min，分離出血清和細胞碎片。分離出的上層血清冷凍在-80℃中儲藏待用。

抽吸400 μl血清后用mirVana PARIS試劑盒（美國Ambion公司）提取包含miRNAs在內的總RNA。目前對qRT-PCR探針法尚無統一的參照物規定，所以我們在加入變性液后將人工合成線蟲miR-39（Invitrogen公司）以10-4pmol/μl濃度加入每個血清樣本中，充當管家miRNA[6]。變性后，對水狀的總RNA進行洗脫、定量，再儲存至-80℃冰箱中。

1.3 SOLiD測序

隨機選出并分別混合3例懷有CHD胎兒的母體血清和3例對照組母體血清，提取總RNA后，將同等質量的總RNA進行連接、逆轉錄以及PCR擴增，應用SOLiD System Small RNA Analysis Pipeline 工具進行邊合成邊測序，最終選出11個差異表達的miRNAs進行驗證。

1.4 逆轉錄和定量PCR（qPCR探針法）

剩余27對樣本分別使用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒和miRNA特異逆轉錄探針將總RNA逆轉錄成cDNA。逆轉錄條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保持。隨后將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增，條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s和60℃ 1 min 40個循環，所有標本均檢測3次。采用相對定量方法（2-△△CT法）對定量結果進行比較分析。

1.5 統計學分析

用SPSS 13.0軟件進行統計分析。人口統計及臨床特點的分析使用t檢驗，而對兩組間的母體血清miRNAs表達水平的統計則用曼-惠特尼U檢驗。P＜0.05提示差異有統計學意義，所有統計學檢驗均為雙側。

2 結果

表1 母體血清miRNAs的相對表達量

2.1 發現生物標記物

在3對樣本中，我們通過計算序列中miRNAs的平均表達量和差異倍數，總共選出11個異常表達miRNAs進行驗證，其中9個為上調2倍以上miRNAs（miR-19b，miR-26a， miR-375，let-7a， miR-22，miR-21 miR-221, miR-29c and miR-15b），2個為下調0.5倍以上miRNAs（miR-27b and miR-24）。

2.2 驗證miRNAs

在剩余的27對樣本中，運用qRT-PCR探針法發現，有4個miRNAs（miR-19b, miR-22, miR-29c，miR-375）在病例組中顯著高表達，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 母體血清miRNAs對胎兒先天性心臟病的診斷價值

我們隨后對這4個miRNAs分別畫了ROC曲線，并計算了曲線下面積（AUC）來評估每個miRNA診斷胎兒CHD的靈敏性和特異性。miR-19b，miR-29c，miR-375 和miR-22的具體靈敏性和特異性分別是74.1% 和77.8%，63.0% 和88.9%，70.4%和66.7%, 55.6% 和85.2%，見圖1。

3 討論

前期大量研究已經證實了CHD與新生兒死亡率的密切關系，但直到現在仍沒有一項檢測胎兒CHD的金標準。在這項研究中，我們分別提取了正常孕婦和懷有CHD胎兒孕婦的血清，旨在通過檢測其中miRNAs的不同表達，將其作為胎兒CHD早期篩查的生物標記物。經證實，有4個miRNAs（miR-19b，miR-22，miR-29c and miR-375）在胎兒CHD中顯著高表達，且靈敏性和特異性均較高，在臨床中具有良好的指導價值。

圖1 4個miRNAs的ROC曲線

自從lin-4作為第一個被發現的miRNA以來[7]，已證實血清/血漿miRNAs與多種疾病相關，而對于CHD來說，有專家發現miR-133、miR-1、miR-196a、miR-138、miR-126可以通過造成心肌肥大，發育順序顛倒、血管內皮生成等方式造成心血管畸形[8-9]。此次發現的4個miRNAs中，miR-19b-1可以抑制血管生成，減慢內皮細胞增殖[10]；miR-22表達上調會激活心肌纖維細胞加快心臟衰老[11]；而miR-375和miR-29c則被認為對食管鱗癌、鼻咽癌等有致癌作用[12-13]。目前尚沒有研究報道，這4種miRNAs與先天性心臟病相關。

總之，我們發現并證實了miR-19b、miR-22、miR-29c、 miR-375這4種miRNAs可以作為產前篩查胎兒CHD的關鍵性非侵入性生物標記物。而如果要將這4個血清miRNAs應用到臨床實踐中還需要更多的研究和優化。

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撰寫醫學論文的基本要求

一、科學性 指論文所介紹的方法、論點，是用科學方法來證實，經得起實踐的考驗。這就要求：

（1）進行科研設計時有周密的考慮，排除可能干擾結果的不利因素；

（2）設立必要的對照組，甚至雙盲對照研究；

（3）對實驗和觀察的數據，要進行統計學處理；

（4）無論是理論研究或實驗研究，對結果的分析要從本課題資料出發，得出恰當的結論，切忌離題空談設想和抽象推理。

二、先進性（創造性） 是指論文是否達到一定的科學水平，一篇論文盡管具備了科學性，但不一定是先進的，因為這個工作可能在數年前甚至十幾年前已被別人證實過了。醫學論文的先進性，可以從兩個方面來衡量：

（1）是理論水平，如原理探討，療效機制等是否有新的突破；

（2）是實踐水平，如診斷水平或治療效果是否高于一般水平及技術操作是否特別先進；但不論是實踐水平或是理論水平的衡量，均應與同類成果現時的水平相比較，如與國外的、國內的、本地的同類課題水平比較才能給予評價。

三、實用性（應用性） 一是與臨床聯系的課題，二是可重復性。

Identification of Maternal Serum MicroRNAs as Novel Noninvasive Biomarkers for Prenatal Detection of Fetal Congenital Heart Defects

ZHU Shasha Cardiology Department, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Jiangsu 215006, China

ObjectiveCongenital heart defects (CHD) are the most common form of malformation during embryonic development. Our current study focused on the altered expression of maternal serum miRNAs and their correlation with fetal CHD.MethodsFrom 18～22 weeks of gestation in maternal serum total RNA, then using SOLiD sequencing and fuorescence quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) method to detect the relative expression of miRNAs in maternal serum, calculate the sensitivity and specificity of the application of statistical methods.ResultsmiR-19b, miR-22, miR-29c and miR-375 expression of the 4 miRNAs in maternal serum with fetal congenital heart disease increased signifcantly, and they are used as markers of the area under the curve (AUC) were 0.790, 0.671, 0.767 and 0.693, can efectively discover fetal congenital heart disease.ConclusionThe results showed that there are 4 kinds of serum miRNAs can be used as a key non-invasive biomarker for prenatal diagnosis of fetal congenital heart disease.

Maternalserum miRNAs, Biomarkers, Congenital heart disease

R714.51

A

1674-9308（2016）36-0059-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.36.032

蘇州大學附屬第一醫院心內科，江蘇 蘇州 215006