革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥機制研究進展

楊 剛 綜述,尹 寧 審校

(新疆醫科大學第六附屬醫院，新疆烏魯木齊 830002)

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革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥機制研究進展

楊 剛 綜述,尹 寧△審校

(新疆醫科大學第六附屬醫院，新疆烏魯木齊 830002)

革蘭氏陰性菌； 抗菌藥; 藥物耐受性; 碳青霉烯類

革蘭陰性桿菌是感染性疾病特別是住院患者醫院感染的主要病原菌，臨床分離的致病性多重耐藥的革蘭陰性桿菌中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌占據前幾位。隨著臨床抗生素的濫用，該類細菌不僅對常用抗生素耐藥，而且對碳青霉烯類藥物的耐藥率也逐年上升。現將耐碳青霉烯類藥物耐藥機制研究進展綜述如下。

1 碳青霉烯酶對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制

碳青霉烯酶是指能明顯水解亞胺培南或美羅培南的一類β-內酰胺酶，是β-內酰胺酶家族中最多變的成員，但碳青霉烯類藥物并非其唯一水解底物。碳青霉烯酶根據活性部位水解機制分為兩種主要的分子家族：一種來源于革蘭陽性桿菌，可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制，稱為金屬酶(MBLs)，其活性部位含有Zn2+有助于水解β-內酰胺的雙環；另一種最初發現于腸桿菌科細菌，其活性部位含有絲氨酸，該類碳青霉烯酶能被克拉維酸和他唑巴坦抑制，但不能被EDTA抑制。按照分子類型可將碳青霉烯酶分為Ambler A、B、D類[1]，A、D類活性中心有絲氨酸，又稱為絲氨酸酶，屬于Bush分群中的第2f、2d亞組。B類活性中心含有Zn2+，稱為MBLs。屬于Bush分群中的第3組，可由染色體、質粒或轉座子介導。

1.1 A類碳青霉烯酶 最主要的A 類絲氨酸碳青霉烯酶有3個家族即SME(serratia marcescens enzyme)、KPC(klebsiella pneumoniae carbapenemases)和NMC(non-metallo carbapenemases)/IMI(imipenemas)，均由染色體編碼，其水解機制是在活性中心70號位含有絲氨酸。SME家族包括 SME-1、SME-2、SME-3。SME-1是在1982年發現于英格蘭的2株黏質沙雷菌。NMC、IMI酶有97%氨基酸是相同的，其均含有相同的活性部位保守序列S-X-X-K、S-D-N和K-T-G，且在其氨基酸殘基的69、238號位形成二硫鍵。這種二硫鍵普遍存在于A類碳青霉烯酶，不僅對其水解活性十分必要，而且能夠穩定酶的結構[2]。在NMC-A、IMI-1和 SME-1基因編碼區的上游存在與LysR家族有關的DNA結合轉錄調控基因，當刪除nmcR調控基因時就可消除NMC-A的誘導表達并可降低碳青霉烯類藥物對其的最低抑菌濃度(MIC)。

KPC、GES(guiana extended-spectrum β-lactamase)均由質粒編碼，KPC-1于1996年發現于北卡羅來納，2003年在美國東海岸發現了KPC-1的變體KPC-2，其由單個氨基酸突變所致，隨后KPC在蘇格蘭、哥倫比亞、以色列[3]、中國等國家均有報道。KPC含有活性部位保守序列S-X-X-K、S-D-N和K-T-G。有研究顯示，對碳青霉烯類藥物敏感率下降的肺炎克雷伯菌均產KPC-2，KPC基因位于可移動的質粒上，可以通過質粒、整合子、插人序列的基因元件進行水平傳播，造成暴發流行。有研究發現，blaOXA(編碼OXA的基因)基因位于耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌質粒上，較位于染色體上更容易發生播散。GES/IBC(integron-borne cephalosporinase)家族并不常見，IBC-1在2000年發現于希臘，GES-1則分離于法屬圭亞那的1株肺炎克雷伯菌，該2種酶在活性序列的69、38號位含有半胱氨酸殘基。編碼GES家族的基因位于質粒的整合子上，該類酶具有很廣的水解譜，目前該家族成員眾多，GES-2、GES-3、GES-4、GES-5、GES-6、GES-7、GES-8、GES-9相繼被鑒定出來。

1.2 B類碳青霉烯酶 B類碳青霉烯酶因活性中心含有Zn2+，也稱為MBLs。MBLs首先在銅綠假單胞菌、不動桿菌中被發現。近年來在腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌中也有發現。MBLs編碼的耐藥基因位于細菌染色體、質粒或轉座子上。并以基因盒的形式存在于整合子中。整合子屬于可移動基因元件。可借助整合子的移動、基因盒的插入、切除而導致細菌間耐藥性呈水平傳播[4]，MBLs有較強的水解碳青霉烯類藥物的能力且對常見的β-內酰胺酶抑制劑有抵抗作用。常見的MBLs有VIM(verona integron-encoded metallo-β-lactamase)、IMP(imipenemase)、GIM(german imipenemase)和SIM(seoul imipenemase)，其位于各種整合子結構上，當這些整合子與質粒或轉座子結合時就會介導在各細菌間傳播。第1例可轉移性MBLs基因于1990年發現于日本的1株銅綠假單胞菌，隨后各種獲得性或轉移性MBLs基因相繼被發現[5]。IMP-1能水解亞胺培南、青霉素和廣譜頭孢菌素，但不能水解氨曲南，最早分離于日本的沙雷菌和其他腸桿菌科，在意大利則在鮑曼不動桿菌發現與IMP-1相似的IMP-2[6]，隨后IMP家族成員在世界各地被陸續發現。目前IMP已多達34種。Ⅰ類整合子是耐藥基因DNA的結構基礎，還可整合其他耐藥基因如氯霉素、氨基糖苷類基因，但其自身不能傳播而是通過識別內部轉座子結構來傳播。VIM家族的編碼基因位于染色體的Ⅰ類整合子上，1997年VIM-1在意大利維羅納被發現，隨后其變體VIM-2在法國被發現，二者均分離自銅綠假單胞菌。雖然二者氨基酸序列同源性很高(90%)，但結構明顯不同，這也導致了其酶促動力學的顯著差異。目前VIM家族種類多達15種，其耐藥基因位于相應的Ⅰ類整合子內[7]。其他MBLs還有SPM(sao paulo metallo-β-lactamase)、GIM和SIM，其只在所發現國家局部傳播并未造成世界范圍的流行。這有別于VIM和IMP。SPM-1分離自圣保羅的銅綠假單胞菌，含有該酶的銅綠假單胞菌所致的感染有較高的致死率，其與IMP-1有35.5%氨基酸是相同的，能被EDTA、吡啶二羧酸、二氮雜菲抑制，能水解大多數廣譜抗生素，主要在拉美國家流行。通過對SPM-1的編碼基因區域分析顯示，該區域不是整合子的一部分，而是含有一種新型的轉座子結構和啟動子序列[8]。近年來新型MBLs被發現如TMB-1(tripoli metallo-blactamase)，該酶來自于利比亞的1株木糖氧化無色桿菌。TMB-1與DIM-1、GIM-1同源性分別為62%、51%，blaTMB-1位于染色體上并可嵌入到Ⅰ類整合子中。2011年在日本發現了blaTMB-1 的變體blaTMB-2，多利培南和美羅培南對產TMB-2轉化株的MIC較TMB-1轉化株分別高256、16倍，有更強的耐藥性[9]。

1.3 D類碳青霉烯酶 D類酶也稱為OXA酶(oxacillin-hydrolyzing)，主要存在于腸桿菌科和銅綠假單胞菌屬，由質粒編碼。該類酶很少能被克拉維酸和EDTA抑制。由于其氨基酸序列存在大量可變性，導致有很多變體，目前已知有232種變體[10]。絕大多數OXA酶發現于不動桿菌屬，根據氨基酸同源性將其分為9個亞組。通過對OXA酶分子結構的研究發現，催化絲氨酸殘基位于70～73號位的S-T-F-K序列，而A、D類酶的絲氨酸和賴氨酸均位于此。其水解機制與其他絲氨酸碳青霉烯酶相同，底物和酶結合，在催化絲氨酸部位形成共價酰基，隨后通過脫酰基作用在β內酰胺環的C-N結合處而水解抗生素使其失活。某些D類酶需要一定濃度的CO2，因為CO2可影響Lys70的羧化作用。2003年在土耳其1株肺炎克雷伯菌中分離的OXA-48對亞胺培南的水解效率較分離于不動桿菌屬的OXA酶高9倍，對其分子動力學及晶體結構研究發現，其水解作用依賴于碳青霉烯類藥物的α-羥乙基的旋轉，在活性部位脫去酰基并以此酰化氨基酸殘基[11]。編碼OXA-48基因blaOXA-48(編碼OXA-48的基因)通過可轉移的質粒在各菌種間傳播[12]。鮑曼不動桿菌中的OXA-23、OXA-58通過將OXA質粒介導入易感碳青霉烯類藥物中而具有耐藥作用[13]。

2 外排泵系統耐藥機制

細菌外排系統是一種非特異性耐藥機制，是通過細菌外排泵將進入菌體內的藥物或其他底物排出膜外，已在不同細菌上發現幾十種外排泵，依據氨基酸序列的同源性，將與抗菌藥物相關的膜外排泵分子分為5個主要超家族[14]，包括主要易化子超家族(Mrs)、ATP結合盒(ABC)超家族、耐藥節結化細胞分化(RND)超家族、小多重耐藥性(SMR)家族，多藥和有毒化合物排出(MATE)家族。其中RND超家族在革蘭陰性桿菌耐藥中發揮重要作用如大腸埃希菌中的AcrAB-TolC系統和銅綠假單胞菌中的MexAB-OprM系統。

2.1 鮑曼不動桿菌的外排系統 AdeABC外排系統是鮑曼不動桿菌中認識最早的外排系統。國外有極少數研究提示，AdeABC外排系統的過度表達可引起菌株對碳青霉烯類抗生素如亞胺培南和美羅培南的高水平耐藥。AdeABC外排泵系統屬于RND超家族，AdeB為內膜轉運體，AdeC為外膜蛋白(OMP)，AdeA為膜融合蛋白(MFP)，其共同組成三聚體結構，形成一連續通道跨在外膜和周質之間[15]。有文獻報道，AdeC對耐藥無本質意義，并非必需。AdeAB共同轉錄并可利用另一外膜蛋白質來形成外排泵通道。AdeFGH外排泵是近年新發現的由AdeF、AdeG、AdeH共同轉錄編碼一個RND超家族的外排系統[16]，表現出對氟喹諾酮類、四環素、氯霉素、甲氧芐啶、磺胺甲基異惡唑、十二烷基硫酸鈉(SDS)和某些染料外排的增強。有研究顯示，AdeFGH外排系統在鮑曼不動桿菌的亞胺培南耐藥中發揮作用。

2.2 大腸埃希菌的外排系統 AcrAB-TolC系統是大腸埃希菌產生多藥耐藥性最重要的系統之一，屬于質子依賴型，能同時產生針對有機溶劑、染料、去污劑及多種抗菌藥物(如氯霉素、紅霉素、四環素等)的高水平的多重耐藥。AcrAB-TolC系統主要由3個部分組成，即膜融合蛋白(AcrA)、外排轉運蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)。這些組分及其類似物是大多數革蘭陰性菌產生對多種抗菌藥物、染料和去污劑等多重耐藥的主要機制。AcrB主要的功能域為三聚體，且包含1個大的細胞周質域為典型特征[17]，細胞周質域的每個亞基的構象有細微的差別，均具有1個底物識別位點，但在特定的時間只有1個位點(binding site)被底物所占據，排出位點緊鄰周質但開放于TolC對接域，將底物推入TolC外排；接入位點(access site)緊鄰TolC但開放于周質，準備接受底物。該3個周質域的構象由上述3個位點輪流替換，形成1個類似蠕動泵的機制將底物排出細胞外。AcrA蛋白的作用主要是促進外排體系與細胞膜的融合。AcrB 能識別外排藥物并通過構象改變形成質子和藥物分子逆向轉運的能量轉化體[18]。AcrAB的表達受多種調控因子的調節，分為全局和局部2個調控層次。

2.3 銅綠假單胞菌的外排系統 銅綠假單胞菌中的外排泵主要有 MexAB-OprM、MexCD-OprJ、exEF-OprN和MexXY-OprM，每一種外排泵都包括3個部分：(1)內膜蛋白如 MexB、MexY，其嵌在細菌細胞內膜，可識別抗菌藥物并將其主動轉運出去；(2)OMP如OprM、OprN，二者均位于細胞外膜具有孔蛋白的作用，可將抗菌藥物排出菌體外；(3)膜融合蛋白如MexA、MexX等，位于內、外膜之間，可連接內、外膜。3種蛋白相互連接橫貫整個細胞膜并開口于外膜，將抗菌藥物排出菌體[19]。

3 與膜孔蛋白有關的耐藥機制

革蘭陰性菌被一層具有通透性的外膜包繞，約60%表面覆蓋膜孔蛋白，其聚合起來形成孔道。大多數抗生素發揮活性的決定性因素并不單純取決于外膜的通透性或抗生素的失活，而是取決于二者之間的平衡，外膜通透下降可以放大酶失活造成的抗生素耐藥效應。

膜孔蛋白是OMP中的一類，大腸埃希菌的膜孔蛋白主要有5種：OmpF、OmpC、PhoE、LamB和蛋白K。大多數β-內酰胺類抗生素可通過的膜孔蛋白主要為OmpF、OmpC，而OmpF的通透性較OmpC高10倍。膜孔蛋白的變異可引起細菌對抗生素敏感率下降。肺炎克雷伯菌的膜孔蛋白有OmpK35、OmpK36和OmpK37，OmpK35、OmpK36相當于大腸桿菌中的OmpF、OmpC。OmpK37一般情況下不表達或表達量極少。OmpK35是細菌發生耐藥最主要的膜孔蛋白。Yang等[20]研究發現，膜孔蛋白缺失這一單獨因素并不能引起對亞胺培南的耐藥。對大腸埃希菌來說OMP缺失合并CMY-4、CMY-2、CTX-M-2等可造成其對碳青霉烯類藥物耐藥[21]。

外膜孔蛋白D2(OprD2)是亞胺培南通過銅綠假單胞菌的特異性孔道，編碼OprD2的結構基因位于染色體上，突變可使OprD2蛋白表達減少甚至缺失，從而導致菌體外膜通透性改變使得碳青霉烯類藥物進入菌體受阻，產生耐藥性。此外OprD2還能形成碳青霉烯類藥物特異性結合位點，是目前所知的銅綠假單胞菌中唯一有助于抗菌藥物通過的孔道蛋白[22]。OprD2缺失引起亞胺培南耐藥，而將克隆有OprD2基因的質粒轉導入OprD2缺失的亞胺培南耐藥株中可使其恢復對亞胺培南的耐藥性并在細胞膜上表達OprD蛋白[23]。在銅綠假單胞菌中存在大、小2種孔道蛋白，而大孔通道數量較少或僅有小孔通道，導致銅綠假單胞菌外膜通透性降低，產生耐藥性[24]。

4 與青霉素結合蛋白(PBPs)有關的耐藥機制

PBPs是一組位于細菌細胞內膜上的具有催化作用的酶，在細菌的細胞壁合成中起關鍵作用。在PBPs中大分子PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3為β-內酰胺類藥物作用靶位。當β-內酰胺類藥物與這些靶位結合后可使轉肽酶、轉糖苷酶的活性丟失，細菌的細胞壁不能合成，細菌死亡[25]。可見當PBPs基因發生變異導致蛋白改變，β-內酰胺類抗生素無法與之結合或結合能力降低均可能導致耐藥。銅綠假單胞菌中有8種不同PBPs，其中PBP2、PBP3與碳青霉烯類抗生素耐藥性有關，是細菌保持正常形態及生存繁殖必需的[26]。Farra等[27]研究結果顯示臨床分離的對亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌耐藥性與PBP位點改變密切相關。另一方面PBPs可參與頭孢菌素酶(AmpC酶)表達從而產生耐藥性，這些PBPs均是非必需PBP如在大腸埃希菌中PBP4過表達導致AmpC酶高產，而PBP4失活使其對AmpC酶誘導能力減弱，PBP4有誘導AmpC酶產生的作用[28]。

5 其 他

細菌對碳青霉烯類藥物耐藥往往是多種機制共同發揮作用。通過對1株耐碳青霉烯類藥物的大腸埃希菌研究顯示，其缺少OmpF、OmpC，并攜帶有耐藥基因marR和功能性非翻譯基因yedS[29]。其所表達的蛋白marR和yedS被認為可耐碳青霉烯類藥物。在大腸埃希菌中操縱子marRAB能編碼marR、marA和marB。而marA過度表達可正向調節外排泵AcrAB-TolC，使之表達增加，外排作用增強；另一方面marA可通過MicF這種小RNA來抑制OmpF，使其對碳青霉烯類藥物耐藥。

6 結 語

革蘭陰性桿菌耐碳青霉烯類藥物的耐藥機制是復雜的，往往多種機制共同發揮作用。革蘭陰性桿菌種類繁多，有些耐藥基因可通過質粒在各細菌間相互傳播，導致新的變體的出現。另一方面抗生素的濫用也會使細菌產生新的耐藥基因，造成耐藥率不斷升高。有些細菌自身外排泵高表達，孔道蛋白的改變也會對碳青霉烯酶類藥物耐藥。因此，在臨床要加強對該類細菌的監測，根據細菌藥物敏感試驗結果合理使用抗生素。

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新疆醫科大學科研創新基金資助項目(XJC2012142)。 作者簡介：楊剛，男，在讀碩士研究生，主要從事病原微生物學的研究。△

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2015-07-30)