斑點叉尾鮰和藍點馬鮫魚皮中膠原蛋白的提取與性質研究

黃 雯，袁春紅，徐 萌，王金梅，包建強

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.日本鹿兒島大學，鹿兒島 890－0056）

斑點叉尾鮰和藍點馬鮫魚皮中
膠原蛋白的提取與性質研究

黃 雯1，袁春紅2，徐 萌1，王金梅1，包建強1

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.日本鹿兒島大學，鹿兒島 890－0056）

選取淡水魚斑點叉尾鮰（Ictalurus punctaus，以下簡稱鮰魚）和海水魚藍點馬鮫（Scomberomorus niphonius，以下簡稱鲅魚）魚皮作為原料，進行膠原蛋白的提取研究。提取方法改良如下：在預處理階段，魚皮樣品被盡可能切碎且調節溶液更換頻率；在提取階段，在鹽析步驟前，添加三羥甲基氨基甲烷粉末將醋酸溶液的酸堿值調節至中性。結果表明，應用改良后的方法提取膠原蛋白，提取周期縮短為7 d。鮰魚魚皮膠原蛋白的變性溫度是36.5℃，鲅魚魚皮膠原蛋白是30.5℃。水解電泳圖譜顯示，鲅魚魚皮膠原蛋白比鮰魚魚皮膠原蛋白更易被完全水解，鮰魚魚皮膠原蛋白比鲅魚魚皮膠原蛋白更穩定。

斑點叉尾鮰；藍點馬鮫；膠原蛋白；提取方法

膠原蛋白是一種生物性高分子物質，應用領域包括食品、制藥、化妝品、生物醫學原料、皮革影像業等[1]。膠原蛋白是一種功能性蛋白，一種絲狀蛋白纖維，用以保持皮膚的彈性。人體中存在于皮膚、骨骼、肌腱等部位，用以粘合結締組織。在魚類的骨骼和結締組織中也含有膠原蛋白[2]，主要在真皮、骨、腱、鱗中含量較多。它的結構是由三條多肽α鏈組合而成的三股螺旋結構，分子量約30萬道爾頓，主要組成氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、羥脯氨酸，而且羥脯氨酸為其特征氨基酸[3]。截至2009年ZUCCHELLI等[4]發現XXIX型膠原，被人類報道過的膠原蛋白共有29種。膠原蛋白的結構類型多，大多數膠原蛋白在常溫下不易溶于水，也不易被降解，但易受熱變性。膠原蛋白I型和V型在水產動物中較為廣泛存在。I型膠原蛋白主要由丙氨酸以及糖結合型羥賴氨酸組成。這種膠原蛋白主要分布在魚類與軟體動物的各個器官中，如鮑魚腹足、烏賊類的頭蓋軟骨和皮等[5]。V型膠原蛋白中含大量糖結合型羥賴氨酸，存在少量丙氨酸，其主要分布于蟹類、海蜇[6]、蝦類的肌肉和外皮下膜中。

我國擁有十分豐富的水產資源，然而，在漁業加工過程中大量魚皮、魚鱗、魚骨等被作為下腳料廢棄，所產生的廢棄物數量極為龐大。魚皮中含有的蛋白質主要為纖維狀膠原蛋白，以及少量球蛋白、彈性蛋白、白蛋白等[7]。從這些加工廢棄物中提取膠原蛋白是一項很有前景的研究項目。斑點叉尾鮰（Ictalurus punctaus，以下簡稱鮰魚）是我國最重要的水產養殖魚類之一[9]，自1984年從美國引入我國已推廣到20多個省市，成為我國重要的水產養殖經濟魚類之一[10]。藍點馬鮫（Scomberomorus niphonius，以下簡稱鲅魚），在日本產量巨大，且由于鲅魚肉質不易保鮮，不適合制作成為日本最受歡迎的生魚片，大量鲅魚被浪費。本文選取淡水魚鮰魚和海水魚鲅魚作為原料，采用酸法和酶法提取膠原蛋白并對其進行性質研究，以期為漁業加工中廢棄物的科學利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮰魚于2014年7月購自上海市浦東新區臨港新城古棕路菜市場，鮰魚樣品體長約42 cm，體質量約560 g。鲅魚于2014年8月購自日本串木野養殖場高水株式會社，鲅魚樣品體長約35 cm，體質量約420 g。

本實驗中的化學試劑：0.1 mol·L－1醋酸；0.5 mol·L－1醋酸；0.1mol·L－1NaOH；1 mol· L－1NaOH；6 mol·L－1NaOH；6 mol·L－1HCl；10%正丁醇，上述化學試劑均為分析純。

KUBOTA 6200高速冷凍離心機購自日本久保田株式會社，J-820Q4圓二色譜儀購自JASCO日本分光株式會社，BF 200恒溫水槽購自日本YAMATO科學株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理

在4℃條件下，將新鮮魚皮切下并除去魚鱗，用手術刀切成5 mm×5 mm大小的碎片并稱重5 g，浸入冰水，使用磁力攪拌器反復攪拌魚皮至冰水變清澈。將洗凈的魚皮碎片放入100 mL 0.1 mol·L－1NaOH溶液（W/V：1/20）浸泡24 h去除雜蛋白，每4 h更換一次溶液。待第一次浸泡魚皮溶脹后，用手術刀將魚皮再次切碎，提高浸泡效果。用蒸餾水清洗魚皮至溶液呈中性。用10%正己烷溶液（W/V：1/20）浸泡魚皮24 h去除脂肪，每4 h更換一次溶液。蒸餾水清洗魚皮，至溶液靜置后無分層。

1.2.2 酸法抽提魚皮膠原蛋白

魚皮膠原蛋白的提取方法參考NAGAI等[11]的方法并做了一些優化。將預處理的魚皮浸入0.5 mol·L－1醋酸溶液（W/V：1/20）24 h，期間磁力攪拌器持續攪拌；然后在15 000 g離心力下離心15 min，將上清液冷藏備用。下沉物再次浸于0.5 mol·L－1醋酸溶液（W/V：1/20）24 h，持續攪拌；再次離心之后，得上清液。將兩次上清液緩慢加入Tris粉末并持續攪拌，至終濃度達到0.5 mol·L－1使醋酸溶液調至中性。緩慢加入NaCl粉末并攪拌，待溶液終濃度達到2.6 mol·L－1NaCl，在15 000 g離心力下離心30 min，沉淀物復溶于0.5 mol·L－1醋酸中。先在0.1 mol·L－1醋酸中透析24 h，每4 h更換一次透析液，再將膠原蛋白樣品在蒸餾水中透析24 h，每4 h更換一次透析液。將得到的魚皮酸溶性膠原蛋白（ASC）凍干備用。酸法提取魚皮膠原蛋白的提取周期為6 d。

1.2.3 酶法抽提魚皮膠原蛋白

將酸法抽提魚皮膠原蛋白中第2次離心所得沉淀物放入0.5 mol·L－1醋酸溶液（W/V：1/10）浸泡24 h，期間加入胃蛋白酶20 U·g－1，并持續攪拌；在15 000 g下離心15 min，得到上清液。向上清液緩慢加入Tris粉末并緩慢攪拌，至終濃度達到0.5 mol·L－1使醋酸溶液調至中性。緩慢加入NaCl粉末并緩滿攪拌，至終濃度達到2.6 mol·L－1。在15 000 g離心30 min，沉淀物復溶于0.5 mol·L－1醋酸中。先在0.1 mol·L－1醋酸中透析24 h，每4 h更換一次透析液。再將膠原蛋白樣品在蒸餾水中透析24 h，每4 h更換一次透析液，將得到的魚皮酶溶性膠原蛋白（PSC）凍干備用。酸法提取魚皮膠原蛋白的周期為7 d。

1.2.4 魚皮膠原蛋白的結構鑒定和分子質量計算

采用丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析膠原蛋白的結構，鑒定膠原蛋白的純度并計算其相對分子質量。取0.1mL濃度為1mg·mL－1的鮰魚魚皮ASC、鮰魚魚皮PSC、鮰魚魚肉ASC、鮰魚魚肉PSC、鲅魚魚皮ASC、鲅魚魚皮PSC、鲅魚魚肉ASC、鲅魚魚肉PSC共8個樣品溶液加入8 μL 1 mol·L－1Tris溶液調節pH，加入50μL混合染色液。進樣前用熱水浸泡試管3 min。樣品槽中加入含量10μg的膠原蛋白樣品。使用高分子量蛋白標準樣來標記樣品，計算分子量。分離膠的試劑為：40%Acrylamide，0.5 M Tris 1.5 M Glycine pH 8.9，18.3%glycerin（甘油）0.18% SDS 0.18 mM EDTA，10%APS（過硫酸銨），TEMED（膠凝促進劑），D.W.（雙蒸水）。濃縮膠的試劑為：0.5 M Tris－HCl（pH 6.8）0.4%SDS，40%Acrylamide，10%APS（過硫酸銨），TEMED（膠凝促進劑），D.W.（雙蒸水）。電泳緩沖液：125 mM Tris，375 mM Boric acid（硼酸），0.5% SDS（5倍濃度）。混合染色液：45%甲醇，9%醋酸，0.25%CBB考馬斯亮藍。脫色液：45%甲醇，9%醋酸[13]。

1.2.5 溶解度

1.2.5 .1 pH對魚皮膠原蛋白溶解度的影響

將凍干的魚皮膠原蛋白粉末溶解于0.1 mol ·L－1醋酸中得濃度為3mg·mL－1的膠原蛋白樣品溶液。取10支帶刻度的離心管，分別加入10 mL樣液，用6 mol·L－1HCl、6 mol·L－1NaOH、1 mol·L－1NaOH將樣品溶液pH調至1～10，然后用去離子水加至11 mL。溶液在4℃條件下攪拌10 min，然后以15 000 g冷凍離心30 min。各取1 mL稀釋至10倍，取稀釋后的樣液0.1 mL，加入2 mL Bradford試劑，于室溫放置30 min。用分光光度計測定的吸光值并代入標準曲線方程，得出不同pH條件下膠原蛋白溶液的濃度。

1.2.5 .2 NaCl濃度對魚皮膠原蛋白溶解度的影響

取凍干的魚皮膠原蛋白粉末溶解于0.1 mol ·L－1醋酸中得濃度為6mg·mL－1膠原蛋白樣品溶液。取7支刻度離心管分別加入5 mL 6 mg· mL－1樣品溶液和5 mL濃度依次為0%（w/w）、2%（w/w）、4%（w/w）、6%（w/w）、8%（w/w）、10%（w/w）、12%（w/w）的NaCl溶液。各樣品終濃度依次為0%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）。充分混合震蕩，在15 000 g下冷凍離心30 min。各取1 mL稀釋至10倍，將稀釋后的樣液取0.1 mL，加入2 mL Bradford試劑，于室溫放置30 min。用分光光度計測定的吸光值代入標準曲線方程，得出不同NaCl濃度下膠原蛋白溶液濃度。

1.2.6 熱穩定性

取一定量的膠原蛋白凍干粉末溶解于0.1 mol·L－1醋酸溶液中配成濃度為1 mg·mL－1的膠原蛋白樣品溶液。在15 000 g下冷凍離心15 min，取上清液移入光徑為1 mm的比色皿中，10℃下對樣品在200～250 nm波長段進行掃描，掃描速率10 nm·min－1。將膠原蛋白樣品溶液以1℃·min－1速度從10℃加熱至45℃，再次進行掃描。然后將膠原蛋白溶液溫度冷卻至10℃，進行第3次掃描[14]。

將溶解的樣品分別注入1 mm光徑的比色皿中，將膠原蛋白樣品溶液以1℃·min－1速度從10℃加熱至45℃，掃描波長為220 nm。圓二色譜儀通過記錄摩爾橢圓率[θ（λ）]的變化，檢測隨著溫度變化膠原蛋白三螺旋結構解螺旋的情況，計算出變性溫度。

1.2.7 水解實驗

魚皮膠原蛋白的內部結構通過胃蛋白酶進行水解進一步研究。將各6支試管注入0.1 mL 1 mg·mL－1未凍干的膠原蛋白樣品溶液，分別放入30℃和35℃的水浴鍋中水浴加熱，胃蛋白酶濃度為1/40（w/w），水解時間6 h，分別取6個時間點：0 min、30 min、60 min、120 min、240 min、360 min。將樣品加入8μL 1 mol·L－1Tris溶液以調節溶液pH和50μL混合染色液終止水解反應，通過SDS－PAGE觀察膠原蛋白樣品水解結果。

2 結果與分析

2.1 魚皮膠原蛋白結構和分子質量

圖1為8種膠原蛋白樣品的電泳圖譜，電泳圖譜顯示每一種膠原蛋白樣品都由兩條不一樣的α鏈組成，即α1鏈和α2鏈，其中α1鏈的分子量比α2大且含量也更多。由圖1可知，8種膠原蛋白樣品均為I型膠原蛋白[15]，β鏈則出現在所有類型的膠原蛋白中，它是α鏈的二聚體，在圖譜最上端的γ鏈則是α鏈的三聚體。通過對照蛋白標準液標記，β鏈的相對分子質量約為198 KDa，α鏈約為117 KDa。所以，膠原蛋白的相對分子質量約為315 KDa。

圖1 8種膠原蛋白樣品的電泳圖譜Fig.1 SDS－PAGE of fish skin collagen samples

2.2 溶解度

2.2.1 pH值對魚皮膠原蛋白溶解度的影響

實驗結果表明，在酸性溶液中魚皮膠原蛋白更易溶解，如圖2所示。當pH值在1～3之間，膠原蛋白的溶解度較高；隨著pH逐漸上升，魚皮膠原蛋白的溶解度明顯下降。當pH達到7，溶解度最低。堿性溶液中，膠原蛋白的溶解度始終保持在最低水平。

2.2.2 NaCl濃度對魚皮膠原蛋白溶解度的影響

NaCl濃度決定了溶液的離子強度，如圖3所示，隨著NaCl濃度不斷升高（即離子強度增強），魚皮膠原蛋白溶解度明顯下降。當NaCl濃度在0～4%之間，下降趨勢較平緩；當NaCl濃度達到5%，溶解度下降趨勢明顯。分析膠原蛋白溶解度隨NaCl濃度升高而下降的原因，應是隨著離子強度的增加，膠原蛋白分子肽鏈間疏水基團的相互作用增加了。

圖2 pH對魚皮膠原蛋白溶解度的影響Fig.2 Fish skin collagen concentrations of samples at different pH values

圖3 NaCl濃度對魚皮膠原蛋白溶解度的影響Fig.3 Fish skin collagen concentrations of samples at different NaCl concentrations

2.3 熱穩定性

在10℃時對樣品光譜掃描結果見圖4，由圖4可以看出，在220 nm處出現了膠原蛋白的特征峰，表明從魚皮中提取的樣品為擁有完整三螺旋結構的膠原蛋白樣品。當樣品加熱至45℃后降至10℃再次掃描樣品，此時不見正吸收峰，表明膠原蛋白樣品變性，三螺旋結構在加熱過程中解螺旋了。溫度回復至10℃后，解螺旋后的膠原蛋白樣品并沒有重新恢復三螺旋結構，這說明膠原蛋白的受熱變性是不可逆的。

在波長220 nm處，溫度從10℃升至45℃，期間對膠原蛋白樣品進行光譜掃描，將所得曲線微分處理得圖5。由圖5可知，鮰魚ASC、PSC和鲅魚ASC、PSC樣品分別約在36.5℃和30.5℃時處于解螺旋最大速率，所以36.5℃為鮰魚魚皮膠原的變性溫度，30.5℃為鲅魚魚皮膠原的變性溫度，且性質改變無恢復性。

2.4 水解實驗

在30℃、酶濃度1/40（w/w）的條件下，水解實驗中6個時間點鮰魚魚皮樣品所得的SDSPAGE如圖6所示。在30℃時，鮰魚魚皮膠原蛋白基本無法被水解，只有極少量的ASC被水解，而PSC完全沒有水解。分析原因可能由于鮰魚魚皮膠原蛋白的變性溫度為36.5℃，所以在30℃條件下，膠原蛋白有良好的熱穩定性，不易被水解。

圖4 魚皮膠原蛋白樣品的圓二色譜儀掃描（10℃）Fig.4 CD spectrum of fish skin collagen samples（10℃）

圖5 魚皮膠原蛋白樣品的解螺旋Fig.5 Unfolding of fish skin collagen samples

圖6 30℃條件下鮰魚魚皮ASC和PSC的水解電泳圖譜Fig.6 Digestion SDS－PAGE of Ictalurus punctaus skin ASC and PSC at 30℃

圖7 35℃條件下鮰魚魚皮ASC和PSC的水解電泳圖譜Fig.7 Digestion SDS－PAGE of Ictalurus punctaus skin ASC and PSC at 35℃

在35℃、酶濃度1/40（w/w）的條件下，水解實驗中6個時間點鮰魚魚皮樣品所得的SDSPAGE如圖7所示。在35℃下鮰魚魚皮膠原蛋白樣品都能夠被水解，ASC完全被水解，PSC只有部分被水解。由此得出，鮰魚PSC比ASC有更好的穩定性。由鮰魚魚皮膠原蛋白的水解電泳圖譜可以看出，膠原蛋白中的β鏈比α鏈更容易被水解，ASC中的β鏈在30 min時就基本上完全被水解，α鏈在120 min時才大量被水解。對比ASC和PSC的水解所得肽鏈片段基本一樣，除PSC未水解完全部分，可知這兩種膠原蛋白被水解時所斷裂的肽鏈位置一致。

在30℃、酶濃度1/40（w/w）的條件下，水解實驗中6個時間點鲅魚魚皮樣品所得的SDSPAGE如圖8所示。在30℃時，只有少量ASC和PSC被水解，ASC和PSC的水解程度基本一致。與鮰魚魚皮膠原蛋白的水解情況相比，鲅魚魚皮膠原蛋白在30℃時更易被水解，這可能是由于鲅魚魚皮膠原蛋白的變性溫度為30.5℃，所以在30℃條件下，膠原蛋白可以被部分水解。

圖8 30℃條件下鲅魚魚皮ASC和PSC的水解電泳圖譜Fig.8 Digestion SDS-PAGE of Scomberomorus niphonius skin ASC and PSC at 30℃

在35℃、酶濃度1/40（w/w）的條件下，水解實驗中6個時間點鲅魚魚皮樣品所得的SDSPAGE如圖9所示。在35℃下膠原蛋白樣品都能夠完全被水解。ASC和PSC的水解程度也基本一致。由鲅魚魚皮膠原蛋白水解電泳圖譜可以看出，其膠原蛋白中的β鏈與α鏈的水解程度基本一致。對比ASC和PSC的水解所得肽鏈片段是相同的。

3 小結

本研究通過優化提取方法提高了酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的提取效率，將整個提取周期縮短至7 d。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定可知從魚皮和魚肉中提取的膠原蛋白樣品為I型膠原蛋白，計算得出膠原蛋白的相對分子質量約為315 KDa。

圖9 35℃條件下鲅魚魚皮ASC和PSC的水解電泳圖譜Fig.9 Digestion SDS-PAGE of Scomberomorus niphonius skin ASC and PSC at 35℃

鮰魚和鲅魚魚皮膠原蛋白在酸性環境下易溶，在中性和堿性條件下難溶。在離子強度低的溶液中易溶，離子強度高的溶液中難溶。鮰魚魚皮膠原蛋白較鲅魚魚皮膠原蛋白具有更高的熱穩定性，且不易被水解，更適合投入應用產業。所以，鮰魚魚皮較鲅魚魚皮是一種更為優質的膠原蛋白源，具有更大的經濟潛力。

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Isolation and characterization of collagen from skin of Ietalurus punetaus and Scomberomorus niphonius

HUANG Wen1，YUAN Chun-hong2，XU Meng1，WANG Jin-mei1，BAO Jian-qiang1
（1.Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China，2.Kagoshima University，Kagoshima890-0056，Japan）

This paper choseIetalurus punetaus（channel catfish）andScomberomorus niphonius（Japanese Spanish mackerel）fish skin as materials to study the isolation of collagen from skin and meat.In the pretreatment，the fish skin samples were cut into small pieces possibly and the frequency of solution change rate was adjusted；in the extraction step，before salting out of collagen the pH of solution was adjusted to neutral by adding Tris.As a reslut，the extraction yield of collagen reached 22.79%of wet weight by modified method and the extraction duration was 7 days.The denaturation temperature of channel catfish was 36.5℃while the mackerel was 30.5℃.When the digestion temperature was 35℃，it can be completely digested.And the result of SDS-PAGE of digestion showed the collagen from Japanese Spanish mackerel was more easily to be digested than the collagen from channel catfish.Therefore，the thermal stability of collagen from channel catfish skin was more stable than mackerel.

Ietalurus punetaus；Scomberomorus niphonius；collagen；extraction method

TS 254.9

A

1004－2490（2016）02－0198－08

2015－06－16

水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心項目（ZF1206）；上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）

黃 雯（1989－），女，上海人，碩士研究生，食品科學與工程專業。E-mail：hw41618＠163.com

包建強，教授。E-mail：baojq＠shou.edu.cn