DNA甲基化在胃腸道間質瘤中的研究進展

張天聞　季　峰

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·綜述·

DNA甲基化在胃腸道間質瘤中的研究進展

張天聞季峰

表觀遺傳學改變如DNA甲基化、基因組印記、染色體滅活等，在細胞分化、胚胎發育等方面發揮著重要的作用，是腫瘤發生發展的重要機制之一。胃腸道間質瘤(GIST)作為消化系統較常見的腫瘤之一，表觀遺傳學改變特別是DNA甲基化也在GIST發生發展過程中發揮著重要的作用。此文回顧近年來國內外相關文獻，綜述相關基因甲基化在GIST發病、預后評估、治療等方面的研究進展。

胃腸道間質瘤；表觀遺傳學；DNA甲基化

胃腸道間質瘤(GIST)是消化系統最常見的間葉源性腫瘤，c-kit或PDGFRA基因發生功能獲得性突變是其發病的始動因素，其中前者占80%以上[1-2]。GIST的常規治療手段是手術或內鏡切除，但存在一定的局限性[3]。即使病灶完全切除，患者的5年生存率也僅為32%～78%，高危組的術后復發率高達85%～90%[4]，這可能與c-kit基因發生二次突變有關[5]。因此，需聯合分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)如伊馬替尼(imatinib)治療[6-7]。有研究顯示，伊馬替尼可延緩75%～90%患者的疾病進展，5%患者可完全緩解[8]。近年Joensuu等[9]也肯定了放射治療聯合靶向藥物在GIST治療中的價值。但部分患者會發生繼發性耐藥，且野生型[10]及PDGFRA D842、D846V突變型[11]對伊馬替尼并不敏感。因此亟需其他方法來克服當前的問題，鑒于表觀遺傳學改變如DNA甲基化在GIST發病過程中的重要作用而越來越受到重視，本文回顧相關文獻就此研究進展作一綜述。

1　DNA甲基化的作用機制

DNA甲基化是最常見的基因修飾方式之一，由DNA甲基轉移酶(DNMT)及去甲基酶協同完成。DNA甲基化的位點常在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，在DNMT的作用下選擇性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶[12]。DNMT有5種，分別為DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L，其中DNMT1可使半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化，并起到維持甲基化的作用，DNMT3A和DNMT3B則是從頭開始甲基化酶。DNA異常甲基化被公認為是腫瘤發生的重要機制之一，通常發生于基因啟動子的CpG島，引起染色質結構、DNA構象和穩定性以及與蛋白質相互作用方式的改變，從而影響基因轉錄調控，引起基因沉默[13]。有研究顯示，啟動子高甲基化所導致的抑癌基因失活是人類腫瘤所具有的共同特征之一[14]。

2　GIST中的DNA甲基化

2003年House等[15]應用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)對38例發生c-kit基因突變的GIST標本進行了11個抑癌基因(p16/INK4a、APC、MGMT、hMLH1、p73、E-cadherin、RAR-b、RASSF1A、RB、ER、DAPK)的甲基化程度檢測，結果顯示84%的樣本存在異常甲基化，其中最常見的基因為MGMT(47%)、p16(45%)、RASSF1A(40%)、E-cadherin(37%)、hMLH1(34%)及APC(31%)。Okamoto等[16]對115例GIST標本進行分析后，發現4個抑癌基因(RASSF1A、P16/INK4A、E-cadherin、MGMT)存在異常甲基化，且甲基化程度隨著惡性程度增加而逐漸增加，證實了DNA異常甲基化在GIST中的存在并提示相關基因甲基化水平可能與GIST惡性程度相關。

2008年Lasota等[17]發現了一種不存在c-kit基因或PDGFRA基因突變的野生型GIST，以琥珀酸脫氫酶(SDH)缺陷為主要表現[18-19]。SDH復合物位于線粒體膜內層，在電子傳遞鏈及檸檬酸循環中起作用，由SDHA、SDHB、SDHC、SDHD四個亞單位組成。SDHA是催化單位，負責將琥珀酸轉變為延胡索酸，SDHB是一種鐵硫蛋白，負責電子傳遞，SDHC及SDHD是膜錨定單位[20]。SDH缺陷可有不同的臨床表現，如Carney三聯征(支氣管軟骨瘤、多發性胃平滑肌肉瘤、腎上腺嗜鉻細胞瘤)、Carney-Stratakis綜合征(家族性GIST、副神經節瘤)等。該型GIST局限在胃，而腸內罕見。淋巴結轉移是較特征性的表現，但只發生在少數患者中[21]。Haller等[22]發現GIST合并Carney三聯征的患者的SDHC甲基化程度明顯偏高，推測可能與SDHC的異常甲基化有關。目前認為該型GIST可能的發病機制包括：(1)SDH亞單位突變可能改變線粒體凋亡通路，增加氧化應激，導致DNA損傷、基因不穩定及腫瘤形成；(2)SDH缺陷導致琥珀酸積累，后者是α-酮戊二酸的類似物，可競爭性抑制α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶及TET家族，TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶轉化為5-羥甲基胞嘧啶，后者是DNA脫甲基化所需，從而使DNA甲基化水平和基因表達發生改變[19,23]。

DNA低甲基化可引起染色體不穩定、原癌基因激活等，可能也在GIST中起著重要作用。Igarashi等[1]發現致癌基因LINE-1在惡性GIST中的甲基化程度較良性GIST顯著降低，且與腫瘤大小、轉移發生率呈負相關，推測LINE-1基因低甲基化可能在誘導染色體畸變并增加GIST侵襲性方面起著重要的作用。Okamoto等[16]也持相同觀點。近年來Haller等[24]用亞硫酸鹽測序法對76例冰凍標本進行分析，結果顯示致癌基因SPP1啟動子甲基化程度與腫瘤的惡性程度呈負相關，并且應用脫甲基劑可引起劑量依賴的SPP1基因甲基化下調。SPP1是趨化因子樣糖蛋白，分泌進入細胞外基質后與CD44及整合素受體結合，激活PI3K/AKT、RAS/MAPK等細胞內信號通路，通過促進增殖、轉移及血管形成影響致癌潛能[25]，而PI3K/AKT、RAS/MAPK正是GIST中主要的信號通路[26]。

伊馬替尼是治療進展期GIST的有效藥物，但長期用藥易導致耐藥性且停藥后復發率較高。Yang等[27]的研究顯示，長期應用伊馬替尼治療后，抑癌基因PTEN甲基化程度明顯升高，而其轉錄產物可以抑制PI3K/Akt通路[28]，推測長期應用TKI導致PTEN基因甲基化，繼而引起的PI3K/Akt/mTOR通路激活可能是GIST對TKI產生耐藥的原因。

3　DNA甲基化在GIST中的應用

3.1DNA甲基化在判斷疾病預后中的作用

不少文獻報道DNA甲基化可作為判斷GIST預后的指標。House等[15]發現抑癌基因E-cadherin發生甲基化的患者的5年生存率(19%)明顯低于非甲基化者(71%)，推測該基因甲基化是提示GIST預后較差的指標之一，若伴有hMLH1基因甲基化缺失，則腫瘤易早期復發。Okamoto等[16]對115例GIST標本進行分析后發現，RASSF1A基因的甲基化程度隨惡性程度增加而逐漸增加，p16基因甲基化特異性地出現在惡性GIST中，推測RASSF1A基因甲基化是腫瘤形成的早期事件且與進展相關，p16基因甲基化是進展期GIST的特殊事件，可用于疾病分期。此外，甲基化CpG島擴增與芯片組合分析(MCAM)顯示REC8、PAX3、p16等基因發生甲基化者預后顯著變差。國內梁建芳等[29]也得出了類似的結論。張立東等[30]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(PCR)及免疫組織化學法檢測了54例GIST標本及40例正常胃腸斷端組織中maspin基因甲基化和蛋白表達水平，結果顯示隨著GIST侵襲性的增加，maspin基因甲基化程度顯著增加，其蛋白表達顯著降低，推測maspin基因甲基化程度與GIST浸潤進展、復發、轉移密切相關，可用于評估GIST生物學行為。此外，前文提到的LINE-1、SPP1等基因甲基化程度降低與GIST侵襲性呈正相關，均可作為評估預后的指標。

3.2DNA甲基化在疾病治療中的作用

鑒于DNA甲基化在GIST發病過程中的重要作用，不少專家提出將其作為治療靶點，通過逆轉甲基化來治療GIST。DNMT是甲基化的關鍵酶，其表達及活性在多種腫瘤中被發現存在改變[31]。Subramaniam等[32]發現抑制DNMT可增加抑癌基因表達而減少腫瘤發生。Lin等[33]也認為一些可以使DNMT失活的蛋白如MDM2、AKT及CDK的抑制劑可能是治療腫瘤的新方法。目前已有2種藥物(阿扎胞苷和地西他濱)通過抑制DNMT產生脫甲基化作用而使靶基因重新表達，已被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療骨髓異常增生綜合征，但在GIST中的應用價值有待進一步證實[34]。

4　問題和展望

目前有關DNA甲基化仍有許多問題尚待解決，如DNA甲基化如何與其他表觀遺傳網絡協調工作？這些網絡在GIST或其他疾病中發揮了什么作用？哪些能用于預防、診斷和治療[35]？一些結論仍有爭議，如House等[15]認為E-cadherin甲基化與GIST的惡性組織學特征相關，但Saito等[36]則持相反意見。隨著研究的不斷深入，不同基因在GIST中的甲基化程度及其在評估危險度、預后等方面的作用也將被不斷豐富和完善。相信在不久的將來會有一張完整的DNA甲基化譜，為GIST的診斷、治療等翻開新的篇章。

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(本文編輯：林磊)

310003杭州，浙江大學醫學院附屬第一醫院消化內科

季峰，Email: jifeng1126@sina.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.04.011

2016-01-30)