細胞凋亡相關因子與急性呼吸窘迫綜合征的研究進展

林錦明，張興毅

(1.遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院急診科，廣東 珠海 519100；2.遵義醫學院珠海校區，廣東 珠海 519100)

細胞凋亡相關因子與急性呼吸窘迫綜合征的研究進展

林錦明1，張興毅2

(1.遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院急診科，廣東 珠海 519100；2.遵義醫學院珠海校區，廣東 珠海 519100)

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發病機制尚不明確，可能與炎癥反應、氧化/抗氧化失調有關。細胞凋亡逐漸成為本學科研究的重點。細胞凋亡的調控主要是Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白，通過檢測ARDS患者體內相關蛋白的表達，可以對其發病機制進行研究和探討。本文查閱相關文獻，從Bcl-2及其同源體促凋亡的Bax基因及凋亡通路因子Caspase-3進行綜述，闡明與ARDS的相互關系。

細胞凋亡因子；急性呼吸窘迫綜合征；進展

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)常發生于嚴重創傷、感染以及休克后，以呼吸頻數、窘迫和進行性低氧血癥為主要臨床表現，其臨床死亡率可達32%～55%[1]。目前對于本病的發生機制尚不明確，多數學者認為本病的發生可能與炎癥反應、氧化/抗氧化失調有密切關系。但隨著研究的不斷深入，人們發現細胞凋亡在本病的發生和發展過程中似乎扮演著更加關鍵的角色，并逐漸成為本學科研究的重點之所在。眾所周知，細胞凋亡(Apoptosis)是由多種基因控制的一種自主的細胞程序性死亡，是機體維持內環境穩定的一個主動過程。細胞凋亡規律一旦發生改變，個體可能會出現發育異常、畸變甚至死亡，因此其與許多疾病(如腫瘤、內分泌紊亂)的發生關系密切[2-3]。人體內細胞凋亡的過程是由多種因子通過不同機制共同調控的結果，目前發現以下三種細胞因子與ARDS有關。

1 抑凋亡細胞因子Bcl-2

1.1 Bcl-2概述 Bcl-2基因亦稱B細胞淋巴瘤-2基因，是最初在非何杰金淋巴瘤濾泡性的B細胞淋巴瘤中被分離出的一個原癌基因，它因14號和18號染色體易位而激活。這樣的易位導致細胞內Bcl-2產生過度表達，表達的基因負責編碼一個質量為25～26 kD的蛋白，即Bcl-2蛋白。Bcl-2蛋白的C末端由疏水氨基酸組成一個可以延伸的鏈狀結構，此結構可以插入細胞的膜狀結構中，其鏈狀結構的特點與Bcl-2蛋白調節細胞凋亡的能力和方式有著密切關系。Bcl-2蛋白的N端的跨膜區在抑制細胞凋亡中發揮作用[4]。當今研究表明，Bcl-2是一種主要分布于核膜、線粒體外膜和內質網膜的膜結合蛋白，其控制基因位于18q21。Bcl-2基因的研究是通過與B細胞相關的腫瘤中進行的，人們發現在當染色體t(14；18)易位時，Bcl-2表達明顯升高，腫瘤細胞產生相對增多，從而認為Bcl-2可能與腫瘤細胞的產生有著密切的關系。隨著研究的不斷深入，人們發現Bcl-2不僅僅與腫瘤的發生和發展有關，同時與正常細胞的凋亡也有關系。現已證明，Bcl-2可以通過多種途徑參與細胞凋亡過程，它也是多種細胞凋亡調節的關鍵性因子，它的高表達往往可以阻止正常細胞的凋亡程序的啟動，從而延長細胞壽命[5-6]。

1.2 Bcl-2抑制細胞凋亡機制 目前對于Bcl-2抑制細胞凋亡的生理機制，尚未完全闡明，但當前研究顯示其可能通過以下三個方面對細胞的凋亡產生作用[7]：①眾所周知，在細胞凋亡的過程中，反應性氧自由基損傷是其發生的一個重要啟動環節，而Bcl-2具有阻斷體內氧自由基啟動細胞凋亡程序和抗氧化的作用，也正是基于此作用，Bcl-2對細胞凋亡起到一定的調控作用。②位于核膜上的Bcl-2蛋白具有阻斷Ca2+從內質網釋放的作用。在細胞的凋亡過程中，需要消化相關的核酸內切酶參與，而核酸內切酶的活化需要Ca2+的參與才能完成。位于核膜上的Bcl-2蛋白多數集中在核孔復合體區域，因此它與核膜內外的物質轉運、核膜裝配以及核孔復合體的形成密切相關，若其阻斷Ca2+從細胞外向細胞內轉移這一過程，那么細胞凋亡程序則無從啟動，從而起到抑制細胞凋亡的作用。③人們發現，在細胞凋亡的過程后，細胞內細胞色素C減少，而線粒體內細胞色素C增加。Bcl-2可以通過影響線粒體釋放細胞色素C來調節凋亡過程。轉染Bcl-2可以抑制多種因素誘導的腫瘤細胞的凋亡[8]。例如，轉染Bcl-2能夠抑制三尖杉酯堿引起的白血病細胞凋亡。還有，在肝癌細胞內轉染Bcl-2也可以抑制抗Fas單克隆抗體聯合TGF-β引起的肝癌細胞凋亡。研究表明，對Bcl-2進行點突變，將纈氨酸或谷氨酸取代BH1位點的第145位甘氨酸,以纈氨酸取代BH2位點的第155位色氨酸。其表達的Bcl-2蛋白酶失去了原來對放射線或糖皮質激素引起的細胞凋亡的抑制能力，并且它也不可以與Bax形成異源的二聚體。也有研究發現，轉染Bcl-2的反義寡核苷酸能約束腫瘤細胞的Bcl-2的活性，從而促進多種腫瘤細胞的凋亡。有學者將Bcl-2的反義寡核苷酸導入急性髓系的白血病細胞中，結果發現轉染后腫瘤細胞的細胞凋亡率較原來明顯降低，并且其細胞對多種化療藥物的敏感性有所升高。

1.3 Bcl-2與ARDS 目前認為ARDS的基本病理基礎可能是肺泡-毛細血管膜廣泛損傷，從而導致肺水腫和微肺不張。在此過程中，肺泡上皮和肺血管內皮細胞是呈進行性凋亡狀態，而這種凋亡方式可能與炎癥介導有一定的關系，Bcl-2蛋白的表達與炎癥、凋亡密切相關，兩者之間似乎存在一定的聯系，但目前多數研究主要是在體外和動物模型中進行，很少有人在人體中進行觀察。宋勇等[9]在急性期死亡ARDS患者肺臟組織進行研究，結果發現ARDS急性期肺組織細胞凋亡率顯著增加，Bcl-2蛋白表達信號較弱，上述結果不但證實了細胞凋亡是在ARDS中廣泛存在，同時提示抑制細胞凋亡因子Bcl-2的低表達，可能是導致本疾病呈進行性發展的主要原因。

2 促凋亡因子Bax

2.1 Bax概述 Bax定位于細胞漿，也屬于Bcl-2家族成員之一，是Bcl-2家族中被研究最廣泛的促凋亡因子，其自身可以形成同源二聚體，也可以與Bcl-2形成異源的二聚體，其所表達的Bax蛋白與Bcl-2蛋白具有21%的同源性[10]。轉染Bax不僅能引起許多細胞自發凋亡，而且能夠促進多種因素引起的多種細胞凋亡。研究表明，轉染Bax反義寡核苷酸可以延長細胞的生存周期。而在利用Bcl-2基因表達的蛋白產物Bcl-2特異性單克隆抗體上，有學者從人和鼠B淋巴細胞中進行蛋白提取，從而發現Bax(即Bcl-2 associated X protein)[11-12]。隨著研究的不斷深入，Bax的結構也逐漸被人所認識了解，這是一種由192個氨基酸組成，在C’端存在一個具有疏水性的氨基酸，同時在整個蛋白中還含有能夠進行磷酸化的7個絲氨酸/蘇氨酸殘基。利用PCR技術，研究人員發現Bax基因是位于染色體19q13.3～13q13.4上，大小約為45 kB，總共含有6個能夠進行蛋白編碼的外顯子，能夠選擇性的編碼3種不同蛋白質：Bax2α、Bax2和Bax2β。

2.2 Bax促細胞凋亡機制 目前Bax促細胞凋亡的具體機制尚不明確，但隨著對Bax基因的研究，人們似乎可以窺其一角。在Bax基因的編碼區，含有BH1、BH2和BH3三個保守區域，該三個區域與Bcl-2蛋白具有高度同源性，也是Bax自身或與其他的Bcl-2家族成員結合形成同型或異型的二聚體，是參與細胞凋亡調節的基礎。實驗研究顯示，Bax分子中BH3與Bcl-2形成雜二聚體是促進細胞凋亡必要條件[13]，其中BH3區域對Bcl-2等抗凋亡蛋白具有明顯的拮抗作用[14]。同時還有研究顯示，Bax作為Bcl-2的同源體，可以與Bcl-2結合，形成一對可以正負調節的異型二聚體，因此兩者的比例決定了細胞生存還是凋亡，如果Bcl-2與Bax表達平衡，形成的異型/同型二聚體處于均衡狀態，從而細胞可以正常的發育生長；假如Bcl-2表達相對增多，則形成Bcl-2/Bax異型二聚體較多，抑制細胞凋亡，導致細胞生存周期明顯延長；同理，若Bcl-2表達相對減少，則可能形成Bax/Bax同型二聚體較多，則細胞凋亡過程明顯加快，導致細胞生存周期縮短；根據上述情況，Bcl-2/Bax蛋白之間的比例是細胞凋亡或者存活的關鍵因素[9]。有學者發現，許多因素在引起腫瘤細胞凋亡的同時常伴有Bax表達升高，顯示Bax表達升高與腫瘤細胞的凋亡有密切關聯[15-16]。轉染Bax到腫瘤細胞后能促進多種腫瘤細胞的凋亡，有研究人員將Bax導入鱗狀細胞癌細胞中,顯示轉染Bax的腫瘤細胞對化療敏感性顯著加強。使用基因技術將Bax通過皮膚導入小鼠體內后，能夠使耐藥的鱗狀細胞癌生長速度較對照組延緩。也有研究將Bax和Bcl-2分別轉染至白血病細胞后，其轉染Bax的細胞凋亡率會顯著增加,并且對化療的敏感性明顯增強。Kagawa等[17]提示轉染Bax后能顯著抑制肺癌細胞的凋亡，此結果與其是否表達p53是沒有顯著相關性的。目前Bax已經在體內外水平上廣泛地用于黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、卵巢癌和宮頸癌等腫瘤的基因治療研究。

2.3 Bax與ARDS Guinee等[18]的研究發現，在彌漫性肺泡損傷的患者中，其肺組織Bax蛋白的表達顯著性增高。在對14例ARDS患者死亡后肺組織采用TUNEL法以及免疫組化技術分析[9]，結果發現Bax在ARDS急性期患者肺組織中表達顯著上調，并且Bax表達的增加與肺組織細胞凋亡增加呈平行關系，而此時Bcl-2蛋白的表達并未增加。Kiyonari等[19]采用TUNEL法和免疫細胞化學雙染觀察到TUNEL染色較強的肺組織中，Bax含量也顯著增加，提示Bax與ARDS患者中細胞凋亡存在顯著相關性。

3 半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)

3.1 Caspase-3概述 1994年Fernandez-Alnemri等利用RT-PCR技術在BenBank的表達序列標記的數據庫中獲得一段IL-1b轉化酶(ICE)/人美麗線蟲凋亡基因(CED-3)活性中心同源的序列，將其合成探針后，篩選人外周血白血病T淋巴細胞的cDNA文庫，從中克隆獲得一種新基因，它是一個編碼分子量為32 kD的半胱氨酸蛋白酶，因此將其稱為CPP32(Cysteine protease protein，32 kD)。兩周后，另一實驗室的學者也獨立地將這一蛋白基因克隆出來，這些學者分別將其命名為凋亡素(Apopain)、死亡之神蛋白(Yama Protein)和prICE。直至1996年這種蛋白酶才被統一命名為Caspase-3。Caspase-3是Caspase酶系家族中的重要一員，Caspase家族屬于半胱氨酸氨基酸基-特異性蛋白酶[20-22]。Caspase-3前體含有277個氨基酸殘基，與ICE及CED-3有30%及35%的同源性，Caspase-3相對分子質量為12.3×103，存在于細胞線粒體中，是組成呼吸鏈的重要部分[23-25]。目前研究發現，Caspase-3具有雙重功能，首先它參與了線粒體進行氧化呼吸，起到傳遞電子的作用。其次，現代研究認為Caspase-3在細胞凋亡過程中有著不可替代的作用，因為它具有調節細胞凋亡的作用，是細胞凋亡中關鍵的終末剪切酶；也是CTL細胞殺傷機制中主要的組成部分。

3.2 Caspase-3促細胞凋亡機制 由于Caspase家族蛋白酶均參與了細胞凋亡，而且是其中的關鍵因子，故也被稱為死亡蛋白酶。在已經發現的家族成員中，Caspase-3蛋白是位于細胞凋亡有序級聯反應的下游，它最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶，此酶參與DNA修復、基因完整性的監護，因而Caspase-3蛋白是Caspase家族中的最重要的凋亡執行者之一；在細胞凋亡過程中，Caspase-3蛋白是多種細胞凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，是凋亡通路的關鍵執行者。因此，現代研究認為Caspase-3蛋白酶的活化是細胞凋亡進入不可逆轉的階段性標志。正常細胞中，Caspase-3是以無活性的酶原形式存在的，當受到炎癥或者其他病理性因素的刺激時，其天冬氨酸殘基位點的蛋白被水解導致激活，從而引發系列Caspase酶級聯反應，最終啟動細胞凋亡。Tian等[26]對鼠紋狀體細胞凋亡研究發現，戊二酸可以促進Caspase-3前體蛋白(Pro-caspase-3)的表達和活性增加，繼而激活細胞內Caspase-3，導致細胞凋亡發生率明顯增加。近年也有學者通過純化和克隆技術，發現線粒體釋放的細胞色素C也可與凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)結合形成多聚體，通過相關反應后，從而激發了Caspase-3等的活性，最終導致細胞發生凋亡。

3.3 Caspase-3與ARDS 目前認為Caspase-3可能主要通過以下三個方面參與ARDS的發生和發展過程中。①直接參與了肺組織細胞的結果破壞。Caspase-3可以剪切LaminA，從而導致核纖層塌陷、細胞核固有形態改變、染色質聚集濃縮。②Caspase-3能夠抑制脫氧核糖核酸酶(DNA酶)抑制劑的活性，導致脫氧核糖核酸(DNA)釋放增多，直接導致DNA的斷裂。③通過改變重要調控蛋白的功能和活性，誘導細胞程序“吃我”信號，從而出現吞噬。在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷中，Caspase-3蛋白酶表達早期出現升高，48 h后達到峰值[27]，這結果與ARDS肺組織病理損害的進程相符合，表明此時的急性肺損傷與Caspase-3蛋白表達升高是有著密切關聯的。

4 小 結

隨著分子生物學的不斷進展，人們對細胞凋亡與ARDS之間關系的深入研究，發現細胞凋亡可能是預防，甚至是治療ARDS的新手段和方式。核因子-κB的特異性抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)對脂多糖(LPS)所致的急性肺損傷具有較好的調控作用，其中的機制可能與PDTC抑制了凋亡細胞因子的表達、增加了抗凋亡細胞因子的表達有關。這無疑對ARDS的治療提供了新的方法和方式，值得廣大臨床工作者進行進一步的系統研究。

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Correlation between apoptosis-related factor and acute respiratory distress syndrome.

LIN Jin-ming1,ZHANG Xing-yi2.1.The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,Guangdong,CHINA;2.Zhuhai Campus,Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,Guangdong,CHINA

The pathogenesis of acute respiratory distress syndrome(ARDS)is still not clear,which may be related to inflammation,oxidative/antioxidant imbalance.Cell apoptosis has now become the research focus in this field, mainly regulated by Bcl-2,Bax,Caspase-3 protein.Detecting the expression of the apoptosis-related factors in ARDS patients is of great significance to the study of pathogenesis.This paper would illustrate the correlation between apoptosis-related factors and ARDS,including apoptosis-inhibiting gene Bcl-2,apoptosis-enhancing gene Bax,and apoptosis pathway factor Caspase-3.

Apoptosis-related factor;Acute respiratory distress syndrome(ARDS);Progress

R56

A

1003—6350（2016）12—1990—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.031

2015-10-10)

張興毅。E-mail：754213771@qq.com