血清差異蛋白補體C3f和脫精氨酸-C3f的研究現狀*

劉　偉 綜述,王世鑫 審校

(1.天津市第二人民醫院檢驗科/天津市肝病研究所　300192;2.天津市西青區西青醫院　300380)

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·綜述·

血清差異蛋白補體C3f和脫精氨酸-C3f的研究現狀*

劉偉1綜述,王世鑫2△審校

(1.天津市第二人民醫院檢驗科/天津市肝病研究所300192;2.天津市西青區西青醫院300380)

關鍵詞:補體系統；C3f；脫精氨酸-C3f

補體系統是廣泛存在于血清、組織液和細表膜表面的一組精密調控蛋白，是一個復雜的先天免疫監視系統，是人體免疫防御的第一道防線，在抵御病原體和保持宿主體內平衡中發揮關鍵作用。補體系統主要由30多種可溶性蛋白和膜結合蛋白組成，這些蛋白目前被分為三類，包括補體固有成分、多種調節因子和補體受體。在這些成分中,補體固有成分的第三組分(C3)是機體補體系統濃度最高的成分，主要由α和β兩條肽鏈經二硫鍵連接而成。在補體激活過程中，3條補體激活途徑(包括經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑)都需要通過活化的C3形成C5活化酶而進一步發揮級聯放大作用[1-3]。C3f是在C3b失活過程中，從C3b片段上剪切下來的一個17肽[4]。脫精氨酸-C3f(DRC3f)是C3f在羧基肽酶-N作用下脫精氨酸形成的一個16肽。隨著蛋白質組學技術的發展，特別是液體芯片飛行時間質譜技術的出現,發現C3f和DRC3f在多種疾病的發病機制、發現疾病早期診斷標志物和藥物作用靶點等領域具有一定的研究價值[5-7]。因此，本文就補體C3f和DRC3f的結構和功能研究現狀綜述如下，以期對進一步研究提供參考。

1研究背景

蛋白質組學是以研究細胞、組織甚至有機體所表達的全部蛋白質的結構與功能為目的的學科，它是繼基因組學發展后的一個新興的研究領域。蛋白質組學技術隨著蛋白質組學的發展應運而生，它主要包括蛋白質分離技術和蛋白質鑒定技術。

蛋白分離技術就是將目的蛋白從實驗標本的大量蛋白中分離出來的技術，主要分為基于凝膠分離技術和非凝膠分離技術。雙向凝膠電泳分離技術(2-DE)是基于凝膠分離技術的經典方法，被廣泛應用；而非凝膠分離技術的代表技術就是液相色譜技術。質譜技術是蛋白質鑒定的核心技術，它可以分為一級質譜技術和二級質譜技術。一級質譜技術的基本原理是樣品經不同方式的離子源離子化后，根據不同離子間質荷比的差別來確定分子質量以待進一步鑒定，其代表技術為基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)。在此技術中，目的蛋白的鑒定結果是蛋白質荷比，并不能確定其身份，但可用于建立診斷決策樹和神經網絡模型等數模方式。二級質譜技術是對一級質譜技術鑒定出的目的蛋白進行再次離子化的技術，它可以鑒定出蛋白的氨基酸序列，以便后續功能研究[8]。

液體芯片飛行時間質譜技術是一種將蛋白質分離技術和鑒定技術結合起來的新興技術，它主要基于磁珠分選與MALDI-TOF-MS聯合應用，然后通過二級質譜鑒定出蛋白的氨基酸序列而確定蛋白身份。由表面經化學或生物處理的磁珠、磁珠分選儀器及質譜檢測系統三部分構成。血清、尿液、細胞抽提物等標本無需特殊處理，可直接與磁珠結合進行分選，保存了較好的蛋白完整性。由于此技術對小分子蛋白檢出率高，是一種上樣量小、高通量、低耗材的自動化技術，而且重復性好、具有較高的靈敏度和特異性[9-10]，目前已經成為蛋白質組學研究的核心技術。許多不同研究方向的科研工作者，應用液體芯片飛行時間質譜技術對多種疾病進行蛋白質組學研究，均發現差異蛋白C3f或DRC3f，說明它們在疾病的發生發展中普遍參與，因此，具有相當的研究價值。

2C3f和DRC3f的結構和質譜特性

C3f是C3b在失活過程中，從C3b片段上剪切下來的一個17肽，其相對分子質量約為2 021,經二級質譜鑒定其氨基酸序列為NH2-Ser-Ser-Lys-Ile-Thr-His-Arg-Ile-His-Trp-Glu-Ser-Ala-Ser-Leu-Leu-Arg-COOH。

DRC3f是C3f在羧基肽酶-N作用下脫去精氨酸，迅速生成的16肽，其相對分子質量約為1 866，經二級質譜鑒定其氨基酸序列為NH2-Ser-Ser-Lys-Ile-Thr-His-Arg-Ile-His-Trp-Glu-Ser-Ala-Ser- Leu-Leu-COOH。

3C3f功能的研究現狀

3.1矽肺本課題組應用Dynabeads RPC18磁珠與MALDI-TOF-MS聯合檢測技術，對30例非矽塵暴露健康體檢者、30例矽塵暴露患者(0期)、30例可疑矽肺患者(0+期)及25例Ⅰ期矽肺患者的血清進行檢測，共得到5個差異峰，其中相對分子質量5 081和5 066處為表達上調的肽段，2 021、3 954、1 777處為表達下調的峰。選取比較有意義的2 021和1 777的肽段進行二級質譜鑒定其氨基酸序列，結果兩個肽段身份同為補體C3的一個片段-C3f。后續用人工合成的C3f體外培養人胚肺成纖維細胞(MRC-5)，發現C3f均可以抑制MRC-5細胞內及細胞外TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，從而推斷在矽肺中C3f是通過抑制TGF-β1這一途徑來抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達的[11-13]。

3.2系統性硬化癥Xiang等[7]應用疏水相互作用層析18磁珠與MALDI-TOF-MS聯合檢測，對40例硬皮病患者、30例系統性紅斑狼瘡患者、21例類風濕性關節炎患者、30例骨關節炎患者和26名健康獻血者血清標本進行了檢測。研究發現，有一組相對分子質量為1 865、1 778、1 691、1 563、1 450的短肽在硬皮病中顯著表達。經二級質譜鑒定其氨基酸序列，發現這組蛋白是從補體C3b衍生出來的，屬于DRC3f家族。其中DRC3f(相對分子質量1 865)與硬皮病中血管受累程度及疾病的活動度皆有關聯。然后，他們用人工合成的DRC3f和C3f，以及含DRC3f的濾過血清分別刺激微血管內皮細胞和皮膚成纖維細胞，發現DRC3f和C3f可以刺激微血管內皮細胞的增殖而對成纖維細胞的增殖沒有刺激作用。同時，他們還檢測出DRC3f和C3f的刺激均能使血管內皮細胞表達TGF-β1的量增加。之后，他們又證實DRC3f和C3f能夠提高皮膚成纖維細胞TGF-β1生成量,且呈劑量依賴性[14]。由此推斷，在硬皮病發病過程中，DRC3f和C3f可能對皮膚膠原纖維過度沉積起著促進作用。

3.3肝病王劍[15]應用WCX磁珠與MALDI-TOF-MS聯合技術，檢測14例急性乙肝(AHB)、76例慢性乙肝(CHB)、41例肝硬化(LC)和14例原發性肝細胞癌(HCC)患者血清標本，發現相對分子質量為1 866的肽段在輕、中度CHB患者血清中濃度較高，而在重度CHB患者血清中濃度較低，表達差異顯著，然后對其進行二級質譜鑒定身份為DRC3f。之后，他們用新鮮和超濾過的含有DRC3f的輕、中度CHB患者血清以及人工合成的DRC3f和C3f刺激正常人肝細胞(QSG-7701)，發現它們都對肝細胞的增殖有促進作用，同時還發現DRC3f可以降低肝細胞中TGF-β1及Ⅰ型膠原的表達。因此，他們推斷DRC3f可能是重度肝炎的生物標志物,并且可能參與了CHB感染及其病情進展的某種機制[16]。他們還以小鼠為研究對象，發現500 μg/kg地塞米松和800 μg/kgDRC3f在預防刀豆A引起的急性肝損傷中起到的作用是相當的，由此推斷DRC3f對急性肝損傷有保護作用[17]。此外,他們還證實，外源性DRC3f可通過TGF-β1通路抑制肝星狀細胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA等蛋白的表達[18]。

Xin等[19]應用C18反相色譜柱與MALDI-TOF-MS聯合技術，對青島63例診斷為非酒精性脂肪肝(NAFLD)的患者及其正常的雙胞胎同胞的血清進行檢測，發現差異蛋白C3f和纖維蛋白肽A。然后他們用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測NAFLD患者血清和健康人血清各50例，發現C3f和纖維蛋白肽A在兩組間存在顯著差異，并得出結論C3f和纖維蛋白肽A可能是NAFLD的潛在診斷標志物。

3.4其他疾病沈芳芳等[20]利用WCX磁珠的液體芯片飛行時間質譜，在糖尿病腎病維持性透析患者透析前、后的血清中也發現差異蛋白C3f，其在透析前血清中顯著高于透析后血清及透析廢液。

朱德祥等[21]應用免疫金屬親和銅離子磁珠的液體芯片飛行時間質譜，在結直腸癌患者血清中也找到了差異蛋白C3f，其在腸癌患者血清中較正常對照組表達是下調的。

Wang等[6]利用2-DE的液體芯片飛行時間質譜，檢測強肌腱力方(QJF)治療前后的重癥肌無力(MG)患者血清，發現差異蛋白補體C3f在治療后表達上調。

4結束語

補體C3是人體內補體系統中濃度最高的分子，也是補體系統的關鍵分子，3條補體激活途徑都需要通過活化的C3形成C5活化酶而進一步發揮級聯放大作用。C3活化后形成的C3b即為C5活化酶的組成部分，其可在CR1或H因子的幫助下，由H因子分解為iC3b和17肽C3f[4]。有研究表明在C3b失活過程中，前兩步的剪切(也就是C3f和C3dg被剪切出來的過程)可能對C3b的失活具有重要意義[22]，但具體機制尚不清楚。目前，C3f或DRC3f參與補體激活的具體過程和免疫機制也有待發現。因此，期待相關科研工作者給予進一步研究和成果匯報。

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*基金項目：國家自然科學基金面上項目(30771788)；天津市衛生局科技基金項目(06KG10)；天津市應用基礎研究計劃面上項目(06YFJMJC09900)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.028

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1820-03

(收稿日期：2016-03-07修回日期：2016-05-18)

△通訊作者，E-mail:wshx-001@163.com。