不同酸度酸雨對小麥花后氮硫代謝和籽粒蛋白組分的影響

孫其松，黃　潔，吳曉靜，江海東，周　琴

南京農業大學農業部南方作物生理生態重點開放實驗室,江蘇省信息農業高技術研究重點實驗室,南京　210095

不同酸度酸雨對小麥花后氮硫代謝和籽粒蛋白組分的影響

孫其松，黃潔，吳曉靜，江海東，周琴*

南京農業大學農業部南方作物生理生態重點開放實驗室,江蘇省信息農業高技術研究重點實驗室,南京210095

摘要:酸雨是中國重要的環境問題，為研究酸雨對小麥籽粒品質的可能影響，以小麥品種揚麥15和汶農17為材料開展盆栽試驗，研究了不同酸度(pH2.5、pH4.0和pH5.6)酸雨對小麥花后氮硫代謝關鍵酶活性和籽粒蛋白質含量及組分的影響。結果顯示：酸雨處理抑制葉片硝酸還原酶(NR)活性，提高了揚麥15整個灌漿期及汶農17灌漿中后期葉片谷氨酰胺合成酶(GS)活性，促進了葉片蛋白的降解，降低了葉片可溶性蛋白含量。不同酸度酸雨提高了成熟期籽粒中蛋白質含量，酸度越強，增加幅度越大，籽粒中各蛋白組分含量和大部分氨基酸含量也有明顯提高。酸雨提高了揚麥15葉片絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)和O-乙酰絲氨酸硫裂解酶(OAS-TL)活性，但對汶農17硫代謝關鍵酶活性影響較小，酸雨處理還提高了籽粒中二硫鍵和含硫氨基酸含量?？梢娝嵊陮π←湹虼x有不同程度影響，進而影響了小麥籽粒蛋白質含量和組成，酸度越強影響越大，但不同品種對酸雨響應有一定差異。

關鍵詞：酸雨；花后；小麥；氮硫代謝；蛋白質組分

1材料與方法

1.1供試材料

供試小麥品種為汶農17和揚麥15。汶農17，強筋、偏冬性、中晚熟品種，由泰安市汶農種業有限責任公司培育；揚麥15，弱筋、春性、中熟小麥品種，由江蘇里下河地區農科所培育。

1.2試驗設計

開花期選擇同一天開花且生長一致麥穗掛牌標記。分別于開花后0、5、10、15、25和30 d取旗葉，花后 10、15、20、25、30 d和 35 d 取麥穗，用液氮固定后-40℃保存，旗葉去除基部和葉尖，留中間部分，穗子剝取從基部數起第5—12個小穗的第1、2位籽粒，用于各項生理指標的測定。同時取干樣，分器官后于105℃殺青30min后，70℃烘至恒重，干燥貯藏備用。

1.3測定項目與方法

游離氨基酸含量測定采用茚三酮比色法[13]，可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G- 250法[13]。硝酸還原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性測定參照現代植物生理學實驗指南[14]。小麥籽粒中各氨基酸組分含量用氨基酸自動分析儀(GB 7649—87)測定，蛋白質含量測定采用半微量凱氏定氮法[14]，以全氮量乘以5.7即為籽粒蛋白質含量，蛋白質組分采用連續提取法[15]。

絲氨酸乙酰轉移酶和O-乙酰絲氨酸硫裂解酶活性測定參照Hartmann方法測定[16]，具體步驟如下：稱取旗葉葉片鮮重1.0g左右置于預先冷凍過的研缽中，加入少量預冷的經酸洗過的石英砂和3mL提取液(30mmol/LTris-HCl，內含10 mmol/L的 DTT)，冰浴下研磨至勻漿，倒入離心管，4℃下14000r/min離心20 min。

O-乙酰絲氨酸硫裂解酶活性測定：取上清液0.1 mL，加入0.1 mL 反應液(50 mmol/L的K2HPO4-KH2PO4(pH7.5)，5 mmol/L DTT，10 mmol/L O-乙酰絲氨酸，2 mmol/L Na2S)。25℃條件下培養10min，50μL 20%(重量體積比)TCA(三氯乙酸)終止反應，4℃下14000r/min離心20min，蛋白質被沉淀出來。上清液轉移到試管中，加入100μL濃縮的醋酸和200μL水合茚三酮試劑(250mg水合茚三酮溶解在10 mL的濃縮醋酸與濃鹽酸(體積比6∶4)中。試管放在煮沸水中煮沸10min，加入550μL 95%(體積比)乙醇，然后迅速冷卻。以半胱氨酸做標準曲線，560nm下測吸光度，然后計算O-乙酰絲氨酸硫裂解酶的活性。

絲氨酸乙酰轉移酶活性測定：取上清液 0.1mL，加入0.1mL 反應液(4 mmol/L絲氨酸，2 mmol/L乙酰輔酶A，50 mmol/L的K2HPO4-KH2PO4(PH7.5)，0.5 mmol/LDTT 和1 mmol/L Na2S)。25℃條件下培養30min，50μL 20% (w/v)TCA(三氯乙酸)終止反應，4℃下14000r/min離心20min，蛋白質被沉淀出來。上清液轉移到試管中，加入100μL濃縮的醋酸和200μL水合茚三酮試劑(250mg水合茚三酮溶解10 mL的濃縮醋酸與濃鹽酸(體積比6∶4)中。試管放在煮沸水中煮沸10min，加入550μL 95%乙醇，然后迅速冷卻。以半胱氨酸做標準曲線，560nm下測吸光度，然后計算絲氨酸乙酰轉移酶的活性。

二硫鍵、硫氫鍵含量測定采用Ellman′S試劑比色法測定[17]。具體步驟如下：稱取100 mg面粉，用1 mL Tris-Gly緩沖液溶解混勻后加入4.7 g鹽酸胍，并用此緩沖液定容至10mL。

—SH含量測定:取該溶液1 mL，加4 mL脲-鹽酸胍溶液和0.05 mL Ellman′S試劑，于412 nm處比色(以不含蛋白的Tris-Gly 緩沖液作對照)。

—S—S—的測定:取該溶液1 mL，加0.05 mL巰基乙醇和4 mL脲-鹽酸胍溶液，25℃保溫1h，加10mL 12%TCA，繼續25℃保溫1h，4000r/min離心10 min，用5 mL 12%TCA清洗沉淀物兩次，將沉淀物溶于10 mL 10 mol/L脲溶液中，加0.05 mL Ellman′S試劑，412 nm處比色測總—SH含量。

—SH含量計算公式:

—SH(μmol /g)=73.53×A412×D/C

—S—S—含量的計算方法:

—S—S—(μmol/g)=1/2(N2-N1)

式中，A412為412 nm 處的吸光值；D為稀釋因子；C為樣品濃度。N1為原有—SH 含量；N2為還原后的總—SH含量。

1.4數據處理

采用Excel 2007軟件處理試驗數據，并用SPSS18.0軟件對試驗數據進行兩因素的方差分析，處理間均值的多重比較用Duncan 新復極差法，試驗結果是3次重復的平均值。

2結果與分析2.1酸雨對小麥氮代謝過程的影響2.1.1酸雨對小麥葉片游離氨基酸含量的影響

兩個品種小麥葉片游離氨基酸含量總體均呈現先上升再下降的趨勢，在花后10d達到最大值，隨后均迅速降低(圖1)。灌漿初期酸雨顯著提高了汶農17葉片中游離氨基酸含量，隨后低于對照，花后30d后，下降幅度小于對照。揚麥15在整個灌漿期酸雨處理游離氨基酸含量高于對照，酸度越高游離氨基酸含量越高。

圖1　不同酸度酸雨對小麥葉片游離氨基酸含量的影響Fig.1　Effect of different acidity acid rain on free amino acid content in leaf of wheat 圖中數值為平均值±標準差(n=3)

2.1.2酸雨對小麥葉片可溶性蛋白含量的影響

兩個品種小麥葉片可溶性蛋白含量隨著灌漿進程的推進不斷下降，酸雨降低了可溶性蛋白質含量，隨酸雨酸度增強可溶性蛋白質含量下降幅度增大(圖2)。pH2.5酸雨處理后，汶農17中可溶性蛋白含量自花后10d起分別較對照降低了26.58%、28.37%、42.08%、55.94%和63.59%，均與對照差異顯著；揚麥15中可溶性蛋白含量自花后10d起分別較對照下降了21.31%、11.14%、22.94%、39.64%和30.99%(P<0.05)。

圖2　不同酸度酸雨對小麥葉片可溶性蛋白質含量的影響Fig.2　Effect of different acidity acid rain on soluble protein content in leaf of wheat

2.1.3酸雨對小麥葉片硝酸還原酶(NR)活性的影響

開花后兩個品種小麥葉片NR活性不斷下降，酸雨降低了NR活性(圖3)。pH2.5酸雨處理后，兩個品種小麥NR活性下降明顯，汶農17酶活性下降的幅度遠大于揚麥15，花后10d汶農17和揚麥15 NR活性分別比對照低30.28%和23.69%。灌漿末期兩個品種小麥NR活性受酸雨影響相對較小。

2.1.4酸雨對小麥葉片谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影響

兩個品種小麥葉片GS活性呈先緩慢上升后快速上升趨勢，峰值出現在花后25d，隨后酶活性迅速下降(圖4)。酸雨對GS活性影響因品種而異，花后0—15d時酸雨提高了揚麥15 GS活性，pH2.5酸雨處理降低了汶農17 GS活性?；ê?0d后，酸雨處理提高了兩品種GS活性，均與對照差異顯著，花后25d時pH4.0和pH2.5酸雨處理使汶農17 GS活性分別提高了7.32%和14.48%，揚麥15 GS活性分別提高了8.44%和20.05%。

圖3　不同酸度酸雨對小麥葉片硝酸還原酶活性的影響Fig.3　Effect of different acidity acid rain on NR activity in leaf of wheat

圖4　不同酸度酸雨對小麥葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig.4　Effect of different acidity acid rain on GS activity in leaf of wheat

2.2酸雨對小麥硫素代謝的影響

2.2.1酸雨對小麥葉片絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)活性的影響

兩個品種小麥葉片SAT活性均隨著灌漿進程的推進，呈先上升后降低趨勢，花后25d酶活性達到峰值(圖5)。酸雨對SAT活性的影響因品種而異，整個灌漿期，酸雨對汶農17 SAT活性影響較小。花后15d后，酸雨顯著提高了揚麥15 SAT活性?；ê?5、20、25、30d時pH4.0酸雨處理與對照相比SAT活性分別提高43.94%、31.69%、22.34%、17.44%，pH2.5酸雨處理與對照相比SAT活性分別提高83.96%、58.47%、26.23%、19.06%，表明隨著酸雨酸度提高，揚麥15 SAT活性升高。

2.2.2酸雨對小麥葉片O-乙酰絲氨酸硫裂解酶(OAS-TL)活性的影響

汶農17 OAS-TL活性變化趨勢與SAT活性變化類似，不同酸雨處理間差異不顯著(圖6)，表明酸雨對汶農17葉片 OAS-TL的影響較小。酸雨提高了揚麥15葉片 OAS-TL活性，且隨著酸度的增加酶活性升高，pH4.0酸雨處理酶活性與對照相比差異基本不顯著。花后15—20d，pH2.5酸雨處理酶活性顯著高于其它兩個處理。

圖5　不同酸度酸雨對小麥葉片絲氨酸乙酰轉移酶活性的影響Fig.5　Effect of different acidity acid rain on SAT activity in leaf of wheat

圖6　不同酸度酸雨對小麥葉片O-乙酰絲氨酸硫裂解酶活性的影響Fig.6　Effect of different acidity acid rain on OAS-TL activity in leaf of wheat

2.3酸雨對小麥籽粒蛋白質及氨基酸含量的影響

2.3.1酸雨對小麥籽?？傆坞x氨基酸含量的影響

小麥籽粒游離氨基酸含量隨著灌漿進程推進不斷下降(圖7)。灌漿前期pH2.5酸雨處理降低了籽粒氨基酸含量，花后10d時，汶農17和揚麥15 pH2.5酸雨處理游離氨基酸含量分別比對照低24.92%和17.44%(P<0.05)。灌漿中后期對照游離氨基酸含量下降速度高于酸雨處理?；ê?5d，汶農17 pH4.0和pH2.5酸雨處理游離氨基酸含量與對照相比分別高66.61%和134.28%，揚麥15 pH4.0和pH2.5酸雨處理游離氨基酸含量與對照相比分別高25.4%和47.01%。

2.3.2酸雨對小麥籽粒蛋白質含量及其組分的影響

從表1中可以看出，酸雨能顯著降低兩個品種小麥籽粒產量，pH4.0、pH2.5酸雨處理使汶農17籽粒產量較對照依次下降了3.48%、13.73%，揚麥15籽粒產量依次下降了2.17%、8.16%。說明兩個品種小麥籽粒產量隨酸度升高而降低，酸雨對汶農17籽粒產量影響更大。酸雨顯著提高了兩個品種小麥籽粒蛋白質含量，但對蛋白質產量影響因品種而異，酸雨顯著升高了揚麥15蛋白質產量，pH2.5酸雨處理降低汶農17蛋白質產量。酸雨提高了清蛋白、球蛋白含量、醇溶蛋白、谷蛋白含量，且隨著pH值的降低，4種蛋白組分升高的幅度增大。

圖7　不同酸度酸雨對小麥籽粒游離氨基酸含量的影響Fig.7　Effect of different acidity acid rain on free amino acid content in grains of wheat

品種Cultivar處理Treatment產量Yield/(g/株)蛋白質產量Proteinyield/(g/株)總蛋白質Protein/%清蛋白Albumin/%球蛋白Globulin/%醇溶蛋白Gliadin/%谷蛋白Glutenin/%pH5.62.26c0.30c13.26c2.38b1.02c4.68c3.03c汶農17pH4.02.18d0.31c13.91b2.53b1.34a4.85b3.44bPH2.51.95e0.28d14.48a2.85a1.37a5.02a3.74apH5.63.05a0.35b12.50d1.92c0.88d3.52e2.83d揚麥15pH4.02.99a0.40a13.32c2.23b1.05c3.67e3.05cpH2.52.80b0.39a13.98b2.44b1.22b3.90d3.66a

表中數值為平均值(n=3)，相同字母表示差異不顯著，小寫字母表示P﹤0.05

2.3.3酸雨對小麥籽粒蛋白質含硫氨基酸和二硫鍵含量的影響

小麥籽粒含硫氨基酸主要是半胱氨酸和甲硫氨酸，從表2中可以看出，酸雨顯著提高了揚麥15含硫氨基酸含量，酸度越高含硫氨基酸含量越高，汶農17不同處理間含硫氨基酸含量差異不顯著。兩個品種小麥籽粒中的硫氫鍵和二硫鍵含量隨著酸雨酸度升高而上升，pH4.0和pH2.5酸雨處理使汶農17硫氫鍵含量與對照相比增加了5.97%和7.93%，揚麥15增加了4.84%和7.63%。pH4.0和pH2.5酸雨處理使汶農17二硫鍵含量比對照增加了3.47%和6.16%，揚麥15增加了2.93%和4.61%。表明和揚麥15相比，酸雨更能提高汶農17硫氫鍵和二硫鍵含量。

2.3.4酸雨對小麥籽粒組成蛋白質氨基酸組分含量的影響

從表3中可以看出，酸雨對小麥籽粒中組成蛋白質其余氨基酸含量有較大影響。在pH4.0和pH2.5酸雨處理下，汶農17籽粒組成蛋白質其余氨基酸含量較對照依次增加了4.83%和8.57%，揚麥15較對照依次增加了14.52%和22.14%，說明酸雨使揚麥15組成蛋白質其余氨基酸含量增加的幅度大于汶農17，且籽粒中組成蛋白質其余氨基酸含量隨著酸度升高而升高。

表2　不同酸度酸雨對小麥含硫氨基酸和二硫鍵含量的影響

表中數值為平均值(n=3)，相同字母表示差異不顯著，小寫字母表示P﹤0.05

表3　不同酸度酸雨對品種小麥籽粒其余氨基酸含量的影響

蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸是必需氨基酸，酸雨提高兩個品種小麥必需氨基酸含量，說明酸雨一定程度上可以提高小麥的營養品質。

3討論

酸雨改變了植物生長的環境，打破了其內部的酸堿平衡，造成植物形態和生理機能的損傷[8]，引起植株生物量或產量的下降。本研究結果顯示在酸雨脅迫下，小麥產量呈下降趨勢，尤其是pH2.5酸雨處理產量顯著下降，與前人研究結論一致[5,12]。不同品種對酸雨響應程度不同，本研究中酸雨對汶農17產量影響大于揚麥15。

酸雨對植物除了具有酸度脅迫效應，也具有氮、硫元素的營養效應，在一定程度上影響植物的氮硫代謝。酸雨對植物氮代謝影響比較復雜，有研究顯示，酸雨處理抑制了杜仲硝酸還原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)等氮代謝關鍵酶活性[18- 19]，降低了小麥葉片氨基酸、可溶性蛋白含量[5]和葉片的含氮量[6,19]。但也有研究顯示酸雨對氮的累積沒有影響[18]或能提高了小麥根系和地上部的含N量[20]及小麥籽粒蛋白質含量[12]。本研究結果顯示強酸雨(pH2.5)處理降低了小麥葉片NR活性和可溶性蛋白含量，表明酸雨可能抑制了葉片蛋白的合成，與前人研究結果基本一致[21]。葉片可溶性蛋白含量的下降也有可能由于酸脅迫下蛋白質的水解加劇所致。本研究結果顯示酸雨處理提高了揚麥15整個灌漿期和汶農17灌漿中后期旗葉GS活性。GS是一種多功能酶，它與氮高效利用、作物耐逆特性密切相關[22]。GS活性提高可促進葉片蛋白降解形成谷氨酰胺，進而運輸到籽粒為蛋白質合成提供底物，這也可能是酸雨處理后葉片游離氨基酸含量不同程度升高及籽粒蛋白質含量升高的原因。

綜上所述，花后不同酸度酸雨降低了小麥籽粒產量，對小麥氮硫代謝也產生了一定影響。酸雨處理抑制了葉片NR活性，在灌漿中后期提高了葉片GS活性，促進氮素的分解轉移，為籽粒蛋白質合成提供底物，總體提高了籽粒氨基酸組分、籽粒蛋白質含量及組分的含量、含硫氨基酸和二硫鍵的含量，有利于兩品種小麥的營養品質提高，但對兩品種小麥加工品質有不同影響。

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Effect of different acidities of acid rain on nitrogen and sulfur metabolism and

grain protein levels in wheat after anthesis

SUN Qisong, HUANG Jie, WU Xiaojing, JIANG Haidong, ZHOU Qin*

MinistryofAgricultureKeyLaboratoryofCropPhysiologyandEcologyinSouthernChina/JiangsuProvinceHi-TechKeyLaboratoryofInformationAgriculture,Nanjing210095,China

Abstract：Recently, acid rain has become a serious environmental problem in China. Acid precipitation has occurred in about 40% of the entire area, especially in the rapidly developing industrial regions, such as the many areas around the Yangtze River. Acid rain is formed when sulfur dioxide (SO2) and nitrogen oxides (NOx) react with water in the atmosphere to produce H2SO4and HNO3and deposit as acid precipitation. Most studies have focused on the effect of acid rain on seed germination, plant morphology, plant carbon metabolism, and grain yield. However, the impacts of acid rain on plant nitrogen and sulfur metabolisms and grain quality have rarely been investigated, although and are known to be the main components of acid rain. Wheat (Triticum aestivum L.) is a staple food and plays an important role in food security. It is sensitive to biotic and abiotic stresses from flowering to maturity. In this study, a pot experiment was performed to determine the effects of spraying of acid rain with varying acidities (pH, 2.5, 4.0, and 5.6) after anthesis on the activities of key enzymes related to nitrogen and sulfur metabolisms and amino acid and protein contents in wheat grains. Two winter wheat cultivars (Yangmai 15 and Wennong 17) were used in this study. The results showed that acid rain inhibited nitrate reductase activity and decreased the soluble protein content of leaves. At 10 days after anthesis, the soluble protein content in Wennong 17 and Yangmai 15 subjected to acid rain (pH 2.5) decreased by 26.58% (P<0.05) and 21.31% (P<0.05), respectively, compared with that in the control. Glutamine synthetase activity in the leaves was increased in Yangmai 15 during the entire grain filling stage and in Wennong 17 only during the late grain filling stage. Acid rain gradually decreased the free amino acid content from the beginning of grain filling stage up to the later stages. The contents of protein and most essential amino acids in mature gains were increased by acid rain and were the highest after treatment with acid rain of higher pH. Acid rain increased the activities of serine acetyltransferase and O-acetylserine(thiol)lyase in Yangmai 15, but had little effect on the activity of key enzymes related to sulfur metabolism in Wennong 17. Acid rain treatment also increased the contents of disulfide bonds and amino acids containing sulfur in the wheat grains of both the cultivars. Thus, acid rain had different influences on wheat sulfur and nitrogen metabolisms, thereby affecting the protein content and composition of wheat grains, and thus its nutritional quality.

Key Words:acid rain; days after anthesis; wheat; nitrogen and sulfur metabolism; protein composition

DOI:10.5846/stxb201408261692

*通訊作者Corresponding author.E-mail: qinzhou@njau.edu.cn

收稿日期:2014- 08- 26;

修訂日期:2015- 05- 22

基金項目:國家自然科學基金資助項目(31170475, 31471445, 30700483)

孫其松，黃潔，吳曉靜，江海東，周琴.不同酸度酸雨對小麥花后氮硫代謝和籽粒蛋白組分的影響.生態學報,2016,36(1):190- 199.

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