2015年版《中國藥典》環磷酰胺有關物質檢測方法的驗證與改進Δ

雷成康，郭 玲（1.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054；2.陜西師范大學生命科學學院，西安 710119）

·藥物分析與檢定·

2015年版《中國藥典》環磷酰胺有關物質檢測方法的驗證與改進Δ

雷成康1＊，郭 玲2#（1.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054；2.陜西師范大學生命科學學院，西安 710119）

目的：改進環磷酰胺有關物質的檢測方法。方法：對2015年版《中國藥典》收載的環磷酰胺有關物質檢測的薄層色譜法（TLC）進行驗證，并對該方法進行改進，以環磷酰胺有關物質A、B、C、D對照品為對照，以二氯甲烷-冰乙酸-甲醇-水（50∶25∶15∶12 V/V/V/V）為展開劑，以茚三酮試液為顯色劑，進行有關物質檢測試驗及方法學驗證。結果：原TLC法不僅無法檢測到環磷酰胺有關物質B、C、D，且操作過程煩瑣，不夠環保。改進后的TLC法對環磷酰胺有關物質A的檢測限約為0.05 μg，對有關物質B、C、D的檢測限約為0.1 μg；方法專屬性試驗結果表明，環磷酰胺與各有關物質之間互不干擾，分離度良好。結論：改進的TLC法具有簡便、環保、靈敏度高的優點，可用于環磷酰胺及其制劑的質量控制。

環磷酰胺；有關物質；薄層色譜法；改進

環磷酰胺（Cyclophosphamide），分子式C7H15C12N2O2P· H2O，化學名為P-[N，N-雙（β-氯乙基）]-1-氧-3-氮-2-磷雜環己烷-P-氧化物一水合物，是目前臨床應用非常廣泛的抗腫瘤藥。環磷酰胺主要以二乙醇胺為起始原料，與氯化亞砜、三氯氧磷及氨基丙醇等經氯化、縮合、環合而成，其生產工藝對溫度及反應時間有嚴格要求。若其生產過程中的關鍵因素控制不當會引起有關物質含量顯著增加；另外，若其長期貯藏于30Ⅲ以上的環境中，則易失去結晶水，引起脫氯而呈黏稠狀[1]。

2015年版《中國藥典》（二部）收載的檢測環磷酰胺有關物質的方法為自身稀釋對照的薄層色譜法（TLC）[2]，該方法不針對任何特定物質。而已知的環磷酰胺有關物質有4種，分別為有關物質A、B、C、D，其中有關物質A、B既是工藝雜質也是降解雜質；而有關物質C、D一般在貯藏過程中產生。據文獻報道，環磷酰胺有關物質A為二（2-氯乙基）胺鹽酸鹽，具高毒性，大鼠腹腔半數致死量（LD50）為100 mg/kg，小鼠皮下LD50為20 mg/kg，對人亦有致突變作用[3]。其他3種環磷酰胺有關物質毒理學資料暫缺，但就藥品質量控制而言，仍有必要對其含量進行檢測。

經檢索有關環磷酰胺質量研究文獻[3-9]，僅袁紅露[3]對環磷酰胺有關物質檢測進行了研究，但其方法為離子色譜法（IC）與高效液相色譜法（HPLC）兩種方法的結合，雖能較精確地定量，但操作方法復雜，檢測成本較高，實用意義稍低。筆者在承擔國家食品藥品監督管理總局國家藥品抽驗科研項目（環磷酰胺）期間，對原有的有關物質檢測的TLC法進行了改進，現將相關情況報道如下。

1 材料

1.1 儀器

預制硅膠G薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號：20140326，規格：100 mm×200 mm，厚度：0.2～0.25 mm）；BT25S型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用環磷酰胺樣品（共47批，江蘇某制藥公司22批，山西某制藥公司20批，吉林某制藥公司5批，規格均為0.2 g）；環磷酰胺有關物質A對照品（批號：170475）、有關物質B對照品（批號：171256）、有關物質C對照品（批號：170476）均購自加拿大TRC公司，有關物質D對照品（批號：F01375）購自美國藥典委員會，標示純度均≥98.0%；茚三酮、無水甲酸、丙酮、丁酮、冰乙酸、甲醇、二氯甲烷、乙醇、鹽酸、高錳酸鉀、碘化鉀、淀粉等均為分析純，水為自制實驗用水。

2 方法與結果

2.1 原TLC法與方法學驗證

2.1.1 原TLC法 取適量的注射用環磷酰胺樣品，用乙醇配制成一定質量濃度的溶液作為供試品溶液，再將此溶液稀釋100倍作為對照溶液。分別取以上兩種溶液點于同一硅膠G薄層板上，用丁酮-水-丙酮-無水甲酸（80∶12∶4∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，在暖氣流下晾干后，于110Ⅲ加熱10 min。在另一展開缸底放置一適宜容器，加入適量高錳酸鉀溶液和鹽酸以產生氯氣，將展開后的薄層板趁熱放入此展開缸中，蓋上蓋子。使薄層板與氯氣接觸2 min，取出薄層板，將其置于冷氣流中，去除多余的氯氣，直至在點樣處的下方滴1滴碘化鉀淀粉溶液后，薄層板僅顯極淺的藍色（避免薄層板過長時間暴露于冷氣流中）。噴以碘化鉀淀粉溶液，放置5 min后立即檢視。供試品溶液如顯雜質斑點（除原點外），其顏色不得深于對照溶液的主斑點（1.0%）。

2.1.2 原TLC法的專屬性驗證 取注射用環磷酰胺樣品及各有關物質對照品適量，以乙醇配制環磷酰胺質量濃度為20 mg/ml及有關物質A、B、C、D質量濃度為20 μg/ml的混合溶液。按“2.1.1”項下色譜條件，吸取上述混合溶液各點樣1、2、3、4、5 μl，依法展開并顯色，結果見圖1。

圖1 原方法的專屬性驗證薄層色譜圖1.1 μl；2.2 μl；3.3 μl；4.4 μl；5.5 μlFig 1 TLC chromatograms of specificity verification by the original method1.1 μl；2.2 μl；3.3 μl；4.4 μl；5.5 μl

結果顯示，原TLC法僅能檢出環磷酰胺有關物質A，而有關物質B、C、D均未能檢出。而未能檢出環磷酰胺有關物質B、C、D的原因是，展開劑丁酮-水-丙酮-無水甲酸（80∶12∶4∶2，V/V/V/V）僅能展開有關物質A，有關物質B、C、D基本停留在原點未展開，呈現為一混合斑點，其Rf值均為0。

2.1.3 原TLC法存在的問題 原TLC法不僅無法檢測到已知的環磷酰胺有關物質B、C、D，且操作過程異常煩瑣，費時費力，其過程中還使用了國家管制試劑（高錳酸鉀、鹽酸、丙酮、丁酮均為易制毒試劑）并生成有毒有害物質（氯氣）。

2.2 改進后的TLC法與方法學驗證

2.2.1 改進后的TLC法 取注射用環磷酰胺樣品適量，以50%甲醇制成環磷酰胺質量濃度為20 mg/ml的供試品溶液；取供試品溶液1 ml，置于200 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。另取各有關物質對照品適量，以50%甲醇分別配制有關物質A、B、C、D質量濃度為20 μg/ml的溶液，作為對照品溶液。取上述3種溶液各5 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-冰乙酸-甲醇-水（50∶25∶15∶12，V/V/V/V）為展開劑，展開約10 cm，取出，晾干，噴以茚三酮試液，于105Ⅲ加熱至斑點顯色清晰，立即檢視。供試品溶液色譜中如顯雜質斑點，其顏色不得深于相應的對照品溶液斑點（0.1%），其他斑點顏色不得深于對照溶液的主斑點（0.5%）。色譜見圖2。

圖2 改進后方法的薄層色譜圖A.有關物質A對照品溶液；B.有關物質B對照品溶液；C.有關物質C對照品溶液；D.有關物質D對照品溶液；E.對照溶液；F.供試品溶液Fig 2 TLC chromatograms of improved methodsA.reference substance solution of related substance A；B.reference substance solution of related substance B；C.reference substance solution of related substance C；D.reference substance solution of related substance D；E.reference solution；F.test sample solution

2.2.2 檢測限考察 精密稱取環磷酰胺有關物質A、B、C、D對照品各適量，以50%甲醇分別溶解并制成1 ml約各含1 μg的溶液。按“2.2.1”項下色譜條件，吸取上述溶液各點樣1、2、3、4、5 μl，依法展開并顯色，以目視能檢出清晰斑點的最低量為檢測限。結果，該方法對環磷酰胺有關物質A的檢測限約為0.05 μg，對有關物質B、C、D的檢測限約為0.1 μg。

2.2.3 專屬性試驗 取注射用環磷酰胺樣品及各有關物質對照品適量，以50%甲醇配制環磷酰胺質量濃度為20 mg/ml及有關物質A、B、C、D質量濃度為20 μg/ml的混合溶液。按“2.2.1”項下色譜條件，吸取上述混合溶液各點樣1、2、3、4、5 μl，依法展開并顯色。結果，采用改進后的TLC法，環磷酰胺的Rf值約為0.97，有關物質A的Rf值約為0.75，有關物質B的Rf值約為0.54，有關物質C的Rf值約為0.45，有關物質D的Rf值約為0.35。環磷酰胺與各有關物質之間分離良好。

2.2.4 空白試驗 以50%甲醇溶液為空白溶液，按“2.2.1”項下色譜條件點樣5 μl，依法展開并顯色。結果，空白溶液未出現與各有關物質對照品溶液主斑點對應的斑點，也未出現其他斑點，表明空白溶液不會對本試驗結果產生干擾。

2.2.5 樣品驗證 按“2.2.1”項下色譜條件和方法對收集到的47批注射用環磷酰胺樣品進行有關物質檢測。結果，僅部分樣品檢出了有關物質A，但均符合“2.2.1”項下的相關限度規定；同時均未檢出有關物質B、C、D及其他有關物質。

3 討論

環磷酰胺及其各種有關物質均為含氮有機物，分子中具胺的結構，根據這個特點，采用茚三酮試液來顯色，具有靈敏度高、直觀、反應迅速的特點，且與原方法所用顯色劑氯氣相比，具有過程簡便、環保的優點。本方法中，環磷酰胺有關物質A顯色后呈橘黃色斑點，有關物質B、C、D顯色后均呈紫紅色斑點。

總結預試驗及專屬性試驗研究結果，本方法的操作關鍵點為：（1）薄層板臨用前須經105Ⅲ活化0.5 h；（2）展開劑及顯色劑茚三酮試液均需臨用新配；（3）展距以不超過10 cm為佳；（4）展開后取出薄層板，以微熱風（40～50Ⅲ）迅速干燥，并及時噴以顯色劑；（5）加熱顯色時間以5～8 min為宜，應隨時觀察，顯色清晰后即可取出。

綜上所述，本方法具有簡便、環保、靈敏度高的優點，通過47批環磷酰胺制劑驗證結果來看方法可行性較好，可用于環磷酰胺及其制劑的質量控制，并可供相關質量標準修訂和提高時參考。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部藥典注釋[S].1990：310.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：586.

[3] 袁紅露.環磷酰胺原料藥中有關物質的分析方法[D].杭州：浙江大學，2014.

[4] 王淼，梁蔚陽.高效液相色譜法測定注射用環磷酰胺的有關物質和降解產物[J].中國生化藥物雜志，2008，29（4）：275.

[5] 梁云愛，李見春，門孝英.環磷酰胺及其制劑的二階導數差示脈沖極譜法定量研究[J].中國藥學雜志，2001，36（9）：620.

[6] 卞曉嵐，翟青.HPLC法測定復方環磷酰胺膠囊中環磷酰胺的含量[J].廣東藥學院學報，2004，20（5）：491.

[7] 劉澄凡，韓遠樂，趙強，等.環磷酰胺的示波極譜法測定[J].分析測試學報，1994，13（5）：48.

[8] 王文輝，楊俊，陳瑤，等.超高效液相色譜-質譜法測定人體血漿中的環磷酰胺[J].光譜實驗室，2011，28（6）：2 887.

[9] 王燕瓊，張順國，徐濤，等.環磷酰胺注射液在玻璃瓶和PVC軟輸液袋中的穩定性考察[J].藥學實踐雜志，2010，28（5）：361.

Validation and Improvement of the Detection Method for Cyclophosphamide Related Substances in Chinese Pharmacopoeia（2015 Edition）

LEI Chengkang1，GUO Ling2（1.Xi’an Institute for Food and Drug Control，Xi’an 710054，China；2.College of Life Sciences；Shaanxi Normal University，Xi’an 710119，China）

OBJECTIVE：To improve the detection method for the related substances of cyclophosphamide.METHODS：The TLC for the detection method of the cyclophosphamide related substances in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition）was verified；the TLC was improved with references of compound A，B，C，D，the expanding agent of dichloromethane-acetic acid-methanol-water（50∶25∶15∶12，V/V/V/V）and the chromogenic agent of ninhydrin solution，and the detection test and methodology validation were conducted for the related substances.RESULTS：The original TLC can not detect the cyclophosphamide related compound B，C，D and the operation process was cumbersome and not environmental protection.The detection limit of improved TLC for cyclophosphamide related compound A was 0.05 μg，and 0.1 μg for related compound B，C，D；specificity method test results showed that cyclophosphamide and the related compounds did not interfere with each other with a good separation.CONCLUSIONS：Improved TLC has the advantages of simplicity，environmental protection and high sensitivity，which can be used for the quality control of cyclophosphamide and its preparations.

Cyclophosphamide；Related compound；TLC；Improvement

R927

A

1001-0408（2016）36-5122-03

2015-12-31

2016-10-30）

（編輯：周 箐）

2014年國家藥品計劃抽驗項目（No.111）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：藥品檢驗及新藥研發。電話：029-85535543。E-mail：cklei168@163.com

#通信作者：實驗師，博士研究生。研究方向：動物實驗及藥物分析。E-mail：glalguo@snnu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.25