骨肽注射液細菌內毒素檢查方法的建立

王婷婷，周 瑞（1.連云港市藥品檢驗所，江蘇連云港 006；.正大天晴藥業集團股份有限公司，江蘇連云港 006）

骨肽注射液細菌內毒素檢查方法的建立

王婷婷1＊，周 瑞2（1.連云港市藥品檢驗所，江蘇連云港 222006；2.正大天晴藥業集團股份有限公司，江蘇連云港 222006）

目的：建立骨肽注射液細菌內毒素的檢查方法。方法：依據2015年版《中國藥典》“細菌內毒素檢查法”項下凝膠法的要求，通過干擾試驗確定樣品主成分最大無干擾質量濃度，并進行方法學驗證。結果：樣品主成分質量濃度稀釋至0.333 mg/ml或以下時對鱟試劑與細菌內毒素的凝集反應無干擾作用。結論：所建立的方法可用于骨肽注射液的細菌內毒素檢查。

骨肽注射液；細菌內毒素檢查；凝膠法；干擾試驗

骨肽注射液是由新鮮或冷凍的豬或胎牛四肢骨提取制成，在臨床上主要用于促進骨折的愈合，也用于增生性骨關節疾病及風濕、類風濕關節炎等的輔助治療[1]。該制劑目前執行的國家藥品標準中所采用的熱原檢查法易受家兔自身因素干擾而出現假陽性或者假陰性結果[2-3]。為了提高該制劑的質量控制水平，筆者依據2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細菌內毒素檢查法”項下凝膠法的要求[4]，并參考相關文獻[5-8]對骨肽注射液的細菌內毒素檢查方法進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

MET-50型智能恒溫加熱儀（天津市天大天發科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

骨肽注射液（安徽宏業藥業有限公司，批號：150208、150504、150652，規格：2 ml：10 mg）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201478，規格：80 EU/支）；細菌內毒素檢查用水（BET水，中國食品藥品檢定研究院，批號：160006-201401，規格：5 ml/支）；鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號：1501071、標示靈敏度：0.25 EU/ml，批號：1503101、標示靈敏度：0.125 EU/ml；湛江安度斯生物有限公司，批號：1502021、標示靈敏度：0.25 EU/ml，批號：1505041、標示靈敏度：0.125 EU/ml）。

2 方法與結果

2.1 樣品細菌內毒素限值（L）的確定

根據公式L＝K/M[4]計算L。式中，K為人每kg體質量在1 h內最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K＝5 EU/（kg·h）；M為人用每kg體質量在1 h內最大樣品劑量，根據樣品說明書靜脈滴注1次最大劑量為20 ml，我國人均體質量按60 kg計，滴注時間按1 h計（不足1 h的仍按1 h計），故M＝20 ml/（60 kg·1 h）＝0.333 ml/（kg·h）。則L＝5 EU/（kg· h）/0.333 ml/（kg·h）＝15 EU/ml。因此，本研究擬定骨肽注射液的L為每1 ml該制劑中含細菌內毒素的量應＜15 EU。

2.2 干擾試驗最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

根據公式MVD＝c·L/λ[4]計算MVD。式中，L＝15 EU/ml；c為供試品溶液的濃度，當L以EU/ml表示時，則c＝1.0 ml/ml；λ為TAL的標示靈敏度（《中國藥品檢驗標準操作規范》[5]建議干擾試驗使用0.5 EU/ml或0.25 EU/ml的TAL，本試驗選擇λ＝0.25 EU/ml的TAL，而進行方法學驗證時選擇λ值較低的TAL），MVD＝（1.0 ml/ml·15 EU/ml）/0.25 EU/ml＝60。

2.3 TAL靈敏度復核

將細菌內毒素工作標準品用BET水溶解，配制成2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ的溶液，按2015年版《中國藥典》（四部）通則1143[4]方法操作，以BET水做2支陰性對照管（NC），對2個廠家生產的TAL進行λ復核。結果，4批TAL復核靈敏度均在0.5λ～2.0 λ范圍內，符合規定，詳見表1（注：“+”表示陽性反應，“－”表示陰性反應，下表同）。

表1 TAL的λ復核結果Tab 1 Recheck results of TAL

2.4 干擾預試驗

取1支細菌內毒素工作標準品，加入1 ml的BET水溶解，混勻后備用。取3批樣品各1瓶，用BET水分別稀釋2、4、8、15、30倍作為供試品陰性對照系列溶液（NPC）；同時，每一稀釋倍數下制備供試品陽性對照系列溶液（PPC，即用該濃度的供試品稀釋液將細菌內毒素標準品制備成2.0 λ濃度）。用λ＝0.25 EU/ml的2個廠家生產的TAL分別與上述2種系列溶液反應，每一稀釋倍數平行做2支管。另取2支管加入BET水作為陰性對照（NC），2支管加入2.0 λ濃度的細菌內毒素標準溶液作為陽性對照（PC）。取以上4種溶液進行干擾預試驗，結果見表2。

表2 樣品干擾預試驗結果Tab 2 Results of interference pretest of samples

由表2可見，3批樣品均分別稀釋15倍后，對2個廠家生產的λ＝0.25 EU/ml的TAL與細菌內毒素的凝集反應無干擾作用。

2.5 干擾試驗

根據干擾預試驗結果，取3批樣品用BET水分別稀釋15倍后作為供試品溶液；用供試品溶液和BET水分別稀釋細菌內毒素工作標準品，制成細菌內毒素濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/ml的系列溶液，每個濃度平行做4支管，分別與2個廠家生產的λ＝0.25 EU/ml的TAL反應。另取供試品溶液和BET水做2支陰性對照管（NC），參考相關文獻[4-8]進行干擾試驗，按公式Es＝lg－1（∑Xs/4）和Et＝lg－1（∑Xt/4）[式中，Es為用BET水制成的細菌內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值；Et為用供試品溶液或稀釋液制成的細菌內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值；Xs、Xt分別為用BET水和供試品溶液或稀釋液制成的細菌內毒素（標準）溶液的反應終點濃度的對數值（lg）][5]計算各系列溶液反應終點細菌內毒素濃度的絕對值，結果見表3。

表3 樣品干擾試驗結果Tab 3 Results of interference test of samples

由表3可見，Es均在0.5 λ～2.0 λ范圍內，且Et均在0.5 Es～ 2.0 Es范圍內，表明樣品稀釋15倍后對TAL（λ＝0.25 EU/ml）與細菌內毒素的凝集反應無干擾作用，可用于細菌內毒素檢查。

2.6 樣品細菌內毒素檢查

取3批樣品各1瓶，分別用BET水稀釋15倍（主成分質量濃度為0.333 mg/ml），使用λ＝0.125 EU/ml的2個廠家生產的TAL進行細菌內毒素檢查，并按相關文獻[4-5]方法做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，結果均符合規定，詳見表4。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果Tab 4 Results of bacterial endotoxins test of samples

3 討論

骨肽注射液是復方制劑，其主要成分是多肽類物質、有機鈣、磷、無機鈣、無機鹽、微量元素等。在建立骨肽注射液細菌內毒素的檢查方法時，首先通過干擾預試驗評價該制劑對TAL與細菌內毒素凝集反應的干擾程度，初步篩選出對細菌內毒素檢查無干擾的樣品主成分質量濃度范圍。最終的干擾試驗和細菌內毒素檢查結果表明，該制劑主成分質量濃度稀釋至0.333 mg/ml或以下時，對TAL（λ＝0.125 EU/ml）與細菌內毒素的凝集反應未見干擾作用，即該制劑采用L＝15 EU/ml進行細菌內毒素檢查是可行的。

本試驗采用的細菌內毒素檢查方法相比于家兔熱原檢查法具有簡便經濟、重現性強的優點，適合于骨肽注射液生產和流通中的快速質量控制。而本試驗的結果可為該制劑在新版的國家藥品標準中將家兔熱原檢查法修訂為細菌內毒素檢查法提供科學依據。

[1] 王常禹，岳云飛，牛惠玲，等.骨肽注射液質量分析及研究[J].藥物分析雜志，2010，30（11）：2 197.

[2]國家食品藥品監督管理局.國家藥品標準WS1-XG-035-2000[S].2003.

[3] 田祥學.細菌內毒素檢查法及其在藥品檢驗中的應用[J].中國醫藥指南，2015（23）：278.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：154-157.

[5] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：310-325.

[6] 丁秀旻.骨肽注射液中細菌內毒定量檢查研究[J].海峽藥學，2007，19（12）：62.

[7] 張娟，祝清芬，范治云，等.氫溴酸山茛菪堿注射液細菌內毒素檢查法的建立[J].中國藥房，2014，25（45）：4 285.

[8] 賈瑞波，劉靜，耿欣.注射用奈達鉑細菌內毒素檢查法的建立[J].中國藥師，2014，17（2）：332.

（編輯：周 箐）

Establishment of Bacterial Endotoxin Test Method for Ossotide Injection

WANG Tingting1，ZHOU Rui2（1.Lianyungang Institute for Drug Control，Jiangsu Lianyungang 222006，China；2.Chia-tai Tianqing Pharmaceutical Co.Ltd.，Jiangsu Lianyungang 222006，China）

OBJECTIVE：To establish the bacterial endotoxin test method of Ossotide injection.METHODS：According to the appendix of the gel method under“bacterial endotoxin test method”in Chinese Pharmacopiea（2015 edition），the maximal non-interference concentrations of samples were determined by interference test，and then methodology validation was conducted.RESULTS：The agglutination of LAL with bacterial endotoxin had no interference when the sample was diluted to 0.333 mg/ml or below.CONCLUSIONS：The established method can be used to detect the bacterial endotoxin of Ossotide injection.

Ossotide injection；Bacterial endotoxin test；Gel method；Interference test

R927

A

1001-0408（2016）36-5151-02

2015-12-30

2016-10-28）

＊主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：124603079@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.35