Beagle犬和正常成人的骨髓像比較

潘嚴

[摘要] 目的 探討Beagle犬骨髓像各個細胞系正常值的參數范圍及其細胞形態學特征，并和正常成人的骨髓像進行了比較，為了給新藥臨床前研究中受試物作用的靶器官是造血系統的臨床前藥物安全評價研究實驗提供診斷依據。 方法 對30只實驗對照用Beagle犬（雌雄各半）和正常成人的骨髓涂片用瑞-姬氏混合染色液染色后進行形態學觀察，油鏡下，分類計數粒細胞系統，紅細胞系統，淋巴細胞系統，單核細胞系統，漿細胞系統及其他細胞，總計500個有核細胞，以百分率表示。高倍鏡下計數全片巨核細胞數并計算其粒紅比值。用SPSS19.0進行配對比較，計算t值和P值。 結果 Beagle犬正常骨髓像中骨髓細胞名稱，骨髓增生變化的分級，骨髓細胞各系統、各階段的細胞形態學的劃分基本是參見人的骨髓細胞學分類標準進行，Beagle犬和正常成人在粒細胞系統，紅細胞系統，巨核細胞系統等六大系統細胞存在顯著性差異（P<0.01或<0.05）。正常情況下，Beagle犬同系同階段的骨髓細胞胞體均比人的略小，犬粒細胞系統可見環核，核染色質比人粗糙，胞質量沒有人的粒細胞胞質豐富；Beagle犬成熟淋巴細胞一般<10%，正常成人成熟淋巴細胞20%～30%；Beagle犬骨髓像中顆粒型巨核細胞明顯比人多，并常見破骨細胞。Beagle犬的粒紅比可簡記為2～2.2倍。人的粒紅比值2～4倍。 結論 Beagle犬和正常成人在骨髓有核細胞增生程度，有核細胞（粒系，紅系，巨核系），淋巴細胞，非造血細胞的數量和形態學特征等方面存在顯著差異。通過犬和正常成人骨髓像的比較，給深入研究藥物對造血系統的改變提供了參考數值。

[關鍵詞] Beagle犬；正常成人；粒紅比值；骨髓像

[中圖分類號] R329 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2016）01-21-05

[Abstract] Objective To investigate the parameter range of the normal value and morphological features of bone marrow cells between Beagle dog and normal adult， and provide a diagnostic basis for the research that the target organs of test samples function in the preclinical study of new medicines is the safety evaluation research experiment of the pre-clinical medicines of hematopoietic system. Methods 30 experimental control Beagle dogs （half male and half female） and normal adults' bone marrow smear were Rui-Ji mixed staining fluid， and morphologically observed. Under the oil microscopy， there were a total 500 nucleated cells， such as differential counting granulocyte system， erythrocyte system， lymphocyte system， monocyte system， plasmocyte system and other cells， which was expressed with a percentage. Under a high power microscopy， the number of megakaryocytes and calculate their myeloid erythroid ratio were counted. Made a pair comparison with SPSS19.0 and compute t value and P value. Results Name of bone marrow cells in normal marrow picture of Beagle dogs， the classification of the change of bone marrow hyperplasia， and the classification of cell morphology of each system and phase of bone marrow cells basically referenced the classification standards of the human's bone marrow cells. P value of granulocyte system， erythrocyte system， megakaryocyte system and so on six big systems cells of Beagle dogs and normal adults was less than 0.01 or less than 0.0005， so there were significant differences. Under normal circumstances， the cell body of the bone marrow cells of homologous Beagle dog in the same phase was slightly smaller than people's， dogs' granulocyte system had a visible core-annulus， and their nuclear chromatin was rougher than people's， and their quality of cells was less rich than peoples' granulocytes； The mature lymphocytes of Beagle dog was usually less than 10%， and the mature lymphocytes of normal adults was between 20% and 30%； The number of granular megakaryocytes in born marrow picture of Beagle dogs was obviously larger than that of people， and there were usually osteoclasts. The myeloid erythroid ratio of Beagle dog could be counted as 2 to 2.2 times and people's myeloid erythroid ratio was 2 to 4 times. Conclusion There are differences in terms of the hyperplasia degree of bone marrow nucleated cells， the number and morphological features of nucleated cells （granulocytes， erythrocytes， megakaryocytes）， lymphocytes， non-hematopoietic cells of Beagle dogs and normal adults. Through the comparison of bone marrow picture of dogs and normal adults， it provides referential data for an in-depth research that the medicines change the hematopoietic system.

[Key words] Beagle dog； Normal adult； Myeloid erythroid ratio； Born marrow group

從1993年以來的新藥非臨床研究技術指導原則，對新藥（諸如一些化學合成藥、生物制劑、中藥）的長期毒性試驗研究中，均要求進行骨髓細胞學檢查[1]。2005年二月版中藥天然藥物長期毒性研究技術指導原則中又明確指出當受試物可能對造血系統有影響時，應進一步進行骨髓檢查[2]。在藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則中也反復強調了重復給藥毒性試驗通常需要制備骨髓涂片，以便當受試物可能對動物造血系統有影響時進行骨髓檢查。技術指導原則重申進行骨髓檢查，體現了骨髓檢查在藥物重復給藥試驗中的重要性。抗腫瘤藥物臨床前毒性研究中也涉及到根據細胞毒類藥物毒性或潛在毒性的情況，按一定比例增加劑量，建立這種比例可接受的終點，包括骨髓抑制等嚴重毒性的直接測定。由于造血系統常常會受到藥物的影響，所以骨髓涂片評價也是在藥物安全性評價中評估藥物對造血系統影響的一個重要的組成部分[3]。劉芳，范玉明等提出了骨髓造血及血液毒理學這一新興的學科概念[4]。李建祥等著重論述了血液毒理學的研究方法包括骨髓的毒性研究[5]。因此研究骨髓像顯得尤為重要。目前關于Beagle犬正常骨髓像的形態學特點和描述及參考數據較少，建立起相關的參考數據，給深入研究骨髓毒性，以及犬等動物的異常細胞學形態提供客觀的數據支持。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本研究收集了北京瑪斯生物技術有有限公司提供的30只Beagle犬（5～6個月齡，雌雄各半）。采用1.5%戊巴比妥靜脈注射進行麻醉，每公斤注射2mL或3mL麻醉放血后，采集第6或第7肋骨，用涂片法制作骨髓涂片。正常成人采用髂骨前上棘穿刺，涂骨髓片與涂血片方法基本一致[6]。

1.2 方法

等骨髓涂片自然晾干或于37℃溫相中促干后，使用珠海貝索生物技術公司出品的瑞氏-姬姆薩混合染色液對骨髓涂片進行染色，一般環境溫度在15～28℃，染色時間為30～40min。當溫度低或高時，可適當分別延長和縮短染色時間。油浸鏡下分類計數500個有核細胞，以百分率表示。高倍鏡下計數全片巨核細胞數，血小板計數25個（成熟有血小板形成和成熟無血小板形成）[7]。

1.3 統計學方法

通過Excel2010版把骨髓細胞各個系統的分類計數值匯總成平均值及標準差，再根據每類骨髓細胞的平均值及標準差用SPSS19.0統計軟件進行兩組獨立樣本的t檢驗，計算t值和P值[8]（詳見表1～2），以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Beagle犬和人骨髓有核細胞分類計數值

根據人骨髓有核細胞增生程度的標準劃分，犬的骨髓像增生程度是增生明顯活躍。參見有核細胞分類計數方法計數500只有核細胞后進行分類匯總，兩者再加以比較。

從表1，2，可以很清楚地看出Beagle犬和正常成人在粒細胞系統，紅細胞系統，淋巴細胞系統，單核細胞系統，漿細胞系統和巨核細胞系統六大系統的細胞，兩者之間存在顯著性差異（P<0.01，P<0.05）。

2.2 犬骨髓細胞形態學特征

2.2.1 粒細胞系統 以成熟階段細胞為主，原幼粒細胞胞體比成熟階段細胞稍大，胞核多呈圓形或橢圓形，核染色質較細致呈沙粒狀，分布較均勻，有3～5個淡藍色核仁，胞漿量少。中性桿狀核粒細胞更多見，相對中性分葉核粒細胞就少一些。嗜酸性粒細胞有時較多見。并且犬的核染色質比人的略粗糙，排列不整齊，著色也不夠均勻。尚有部分細胞的核染色質出現聚集，胞質量也不如人的豐富[10]。

2.2.2 紅細胞系統 以中晚幼紅細胞為主。原、早幼紅細胞的胞核圓形或橢圓形，位于中央或稍偏位，核染色質呈粒狀，有聚集趨勢。原始紅細胞的胞質比原粒細胞的胞質著色更深。犬的中晚幼紅細胞胞體較小，胞質少，邊緣不整齊。

2.2.3 巨核細胞系統 幼巨核細胞的核染色質呈顆粒狀，胞質量多，有細小的嗜天青顆粒。顆粒巨核不規則核染色質粗糙，胞質豐富，含有大量的紫紅色顆粒[11]。Beagle犬的巨核細胞要注意與破骨細胞加以鑒別，兩者最主要的不同點是胞核。而犬成熟型的巨核細胞胞體比破骨細胞略小，胞核巨大不規則或分葉，看不見核仁。細胞周圍可附有血小板，有時可見血小板正在脫出。

2.2.4 淋巴細胞系統 犬的成熟淋巴細胞占有核細胞的比例約<10%左右。細胞特點核偏位，在核一側有少量胞漿，且著色呈半透明狀。

2.2.5 其他細胞 犬的正常骨髓像中成骨細胞比較常見。Beagle犬成骨細胞胞體較大，多為長橢圓形或不規則形，常多個成簇分布，有時單個存在。胞核橢圓形或圓形，常偏于一側，核染色質呈粗網狀排列，胞質豐富，淡藍色，常有空泡，離核較遠處常有橢圓形淡染區偶見少量紫紅色顆粒，胞質邊緣模糊呈云霧狀。成骨細胞又稱為造骨細胞，與漿細胞有許多相似之處，而且有時單個存在，兩者應注意鑒別。

2.3 正常成人骨髓像

正常情況下，人同系同階段的骨髓細胞均比Beagle犬的略大。粒系數目約40%～60%成熟粒細胞中桿狀核多于分葉核分化、形態正常。紅系數目約20%，以中晚幼紅細胞為主平均各約10%。巨核系整張骨髓片可見巨核細胞7～35個，難見原始巨核細胞。產板型巨核細胞占50%～60%，髓片約每25個成熟紅細胞應有一個血小板，不能出現異形和巨大血小板。淋巴細胞約20%，難見到原始淋巴和幼稚淋巴細胞。單核細胞主要是成熟階段數目小于4%，漿細胞主要是成熟階段數目小于2%。骨髓片中可以見到少量非造血細胞，如網狀細胞，吞噬細胞，組織嗜酸細胞等。無異常細胞和寄生蟲，不易見核分裂象。骨髓有核細胞增生活躍。粒紅比正常2～4∶1，粒紅比人可簡記為2～4倍[12]。

2.4 Beagle犬與正常成人骨髓像的差異

Beagle犬有核細胞增生程度是依據人骨髓有核細胞增生程度的標準來定可判斷為增生明顯活躍，雄性犬粒紅比值為（1.48±0.32），雌性犬粒紅比值為（1.23±0.24）。此結果與吉蘭姣，塔娜等[13]測的Beagle犬正常骨髓粒紅比值的結果比較一致（1.25±0.41）。為了便于記憶，犬的粒紅比值可簡化為2～2.2倍。正常成人粒紅比值可以簡記為2～4倍。犬的中晚幼粒細胞胞核可呈環形核[10]，正常成人沒有。犬的中晚幼紅細胞胞漿不如人的豐富，核染色質較人粗糙。淋巴細胞數量比人少，有時能見到異形淋巴細胞2型容易和單核細胞混淆注意鑒別。Beagle犬正常骨髓像中破骨細胞和成骨細胞比較多見，正常成人偶見。以上Beagle犬形態學特征和喬建維，李志榮等狗、大白鼠正常骨髓像觀察[14]一文中所述的犬的細胞形態觀察結果較一致。

3 討論

根據本次研究得出的數據表明Beagle犬與正常成人在骨髓細胞六大主要系統中細胞形態學特征存在不同點，細胞計數值也存在著顯著性差異。依據人的骨髓有核細胞增生程度五級估計，犬的有核細胞與成熟紅細胞的比例是高于正常成人的，這可能與骨穿的部位和方法有密切的關系。目前長期毒性試驗非嚙齒類實驗動物一般選擇犬的股骨作為穿刺部位，穿刺時應當注意骨髓穿刺針垂直刺入皮膚肌肉，抵達股骨轉子窩的位置后再左右旋轉進入骨髓腔，當到達骨髓腔時有落空或疏松感視為已進入骨髓腔，注射器針筒部分可見骨髓液時才能算抽吸完畢[2]。正常成人骨髓穿刺術的方法主要有胸骨穿刺術，髂骨前（后）上棘穿刺術脊突穿刺術和脛骨前穿刺術五種[15]。臨床上穿刺術的選擇依據患者病史、癥狀、體征而定，必要時行多部位穿刺以便能全面了解骨髓情況。每張骨髓涂片最好都含有骨髓小粒，這是骨髓液的特征，以便與血液相鑒別。Beagle犬骨髓涂片時需用種屬動物血清稀釋，注意涂片的厚薄程度，以便全片計數巨核細胞并注意與破骨細胞加以鑒別，兩者最主要的不同點是胞核。破骨細胞胞體巨大，直徑60～100μm，形態不規則，邊緣清楚或不整齊如撕紙狀。胞核小且較多，3至幾十個，圓形橢圓形，大小較一致，彼此孤立，隨意排列，無核絲相連。核染色質較粗糙。胞質極豐富，呈紅藍相間色，胞質中有較多較細小，大小不均排列稀疏的紫紅色顆粒。正常成人骨髓涂片直接推片，不需用血清稀釋。

在新藥安全評價試驗中，Beagle犬的骨髓像很容易受到抗腫瘤藥或者免疫抑制劑如環磷酰胺、米托恩醌的影響發生改變，可見骨髓三系收到明顯抑制，淋巴細胞大量增多，形成骨髓空洞，停藥半個月至1個月后恢復正常骨髓像。這可能和藥物劑量以及動物本身的個體差異有關聯。由本次研究得出Beagle犬骨髓有核細胞分類值和粒紅比值在性別上有不同。正常成人骨髓有核細胞計數值和粒紅比值不分性別，但是兒童骨髓特征有核細胞較成人豐富，幼兒骨髓淋巴細胞值較成人偏高。幼年動物（4～6個月齡的Beagle犬）的骨髓像粒系和紅系與兒童骨髓像相似，紅系偏高。體質較差的Beagle犬呈貧血性骨髓像，鏡下可見嗜酸，嗜堿粒細胞增多，也可見血液寄生蟲[9]。

本次研究顯示Beagle犬正常骨髓像各細胞系，各階段細胞的比值在正常范圍，互相間的比例也正常。Beagle犬和正常成人在骨髓有核細胞增生程度，有核細胞三系（粒系，紅系，巨核系），淋巴細胞，非造血細胞的數量和形態學特征等方面存在明顯的差異。

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（收稿日期：2015-10-09）