HPLC法測定生物羊膜浸泡5—氟尿嘧啶藥物吸收量

周揚　趙爽　張晨明

[摘要]目的 建立生物羊膜（面積為8mm×10mm）中5-氟尿嘧啶（5-Fu）濃度的HPLC測定法以觀察不同浸泡時間生物羊膜浸泡5-Fu藥物吸收量。 方法 色譜柱為Diamonsil（鉆石）C18（4.6mm×250mm，5?m），流動相為甲醇-水（2︰98），流速為1.0mL/min，紫外檢測波長為266nm，生物羊膜吸收液為5-氟尿嘧啶注射液（標示量為10mL；0.25g），吸收后用流動相提取，進樣測定。 結果 以5-氟尿嘧啶峰面積為縱坐標，5-氟尿嘧啶濃度為橫坐標，5-Fu在2～100?g/mL濃度范圍內線性關系良好（r=0.9995），浸泡5min，吸收5-Fu為59.004μg/片，浸泡5min，吸收5-Fu為75.839μg/片。 結論 生物羊膜能夠吸附一定量的5-氟尿嘧啶，通過測定羊膜中吸收的5-氟尿嘧啶的量，為臨床以及基礎合理用藥提供依據。

[關鍵詞]高效液相色譜法；5-氟尿嘧啶；生物羊膜

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2016）01-42-03

[Abstract]Objective To establish a HPLC method for determination the concentration of 5-fluorouracil（5-Fu） in biological amniotic membrane （area was 8mm×10mm） to observe the absorption of 5-Fu different soaking time in biological amniotic membrane. Methods Determination was achieved on a Diamonsil （diamonds） C18 （4.6mm×250mm， 5 ?m） with the mobile phase of methanol-water （volume ratio of 2︰98）. The flow rate was 1.0mL/min， the UV detection wavelength was set at 266nm and biological amniotic membrane absorption liquid for 5-Fu injection （mark is 10mL， 0.25g）. The sample was detercted after absorption. Results Ordinate was 5-Fu peak area and abscissa was the concentration of 5-Fu. The linear relationship of 5-Fu in 2-100 ?g/mL concentration range was good （r=0.999 5）. 5min immersion， absorbing 5-FU for 59.004μg/piece， soak 5 minutes， absorbing 5-FU for 75.839μg/piece. Conclusion Biological amniotic membrane can absorb a certain amount of 5-FU.By determinating amount of 5-FU absorbed in the amniotic membrane， provide the basis for clinical and rational use of drugs.

[Key words] High performance liquid chromatography； 5-FU； Biological amniotic membrane

羊膜來源于胚胎。由于沒有人體白細胞抗原的表達，其抗原性很低，無血管、神經和淋巴管。羊膜上皮細胞具有分化的潛能，在特定條件下可分毛囊上皮和皮膚上皮，對促進上皮愈合和降低基質炎癥及潰瘍發揮作用[1-3]。

5-氟尿嘧啶是一種抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶、阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉換成胸腺嘧啶核苷酸，干擾DNA的合成，此外尚能抑制RNA的形成。5-氟尿嘧啶通過無特異性地抑制細胞，減少濾過道瘢痕形成，從而抑制成纖維細胞增生，有利于功能性濾過泡的形成和保持，使術后眼壓保持較好，提高手術成功率而用于青光眼手術[4]。5-氟尿嘧啶對角、結膜細胞有毒性作用，可導致淚膜功能明顯受損，表現為淚液分泌量減少，淚膜穩

定性下降，易患干眼癥。因此在使用時要正確掌握用藥適應證、嚴格控制安全使用劑量。本實驗通過將羊膜在5-氟尿嘧啶注射液中浸泡，采用高效液相方法對羊膜吸收的5-氟尿嘧啶含量進行測定[5]。

1 儀器與藥品

Waters高效液相色譜儀（Waters2695）KFP-486GE/F，Empower工作站，Waters2996紫外檢測器，干燥器，梅特勒-托利多AX205 Delta Range 電子天平（瑞士梅特勒公司），XW-80A型旋渦混合器（上海精科實業有限公司）。

5-氟尿嘧啶標準品（批號：08052897），5-Fu注射液（標示量為10mL；0.25g，上海旭東海普藥業有限公司），生物羊膜（江西瑞濟生物工程技術有限公司），甲醇為色譜純（批號：LOT H02E73，美國J.T.Baker公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil（鉆石）C18色譜柱（5?m，4.6mm×250mm）；流動相：甲醇-水（2︰98）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20?L；檢測波長：266nm。色譜圖見圖1。

2.2 標準溶液的制備

精密稱量5-氟尿嘧啶標準品0.0103g，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度得1mg/mL母液。然后從中精密量取1mL置于另一10mL容量瓶中，用流動相（甲醇-水2︰98）稀釋至刻度，得100?g/mL標準溶液。

2.3 標準曲線的制備

取標準溶液用流動相稀釋，分別配置2，5，10，20，50，100?g/mL標準品系列溶液，分別進樣20?L，連續進樣5次。以5-氟尿嘧啶的峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，得直線方程為Y=6.37×104X+3.59×104，r=0.9995。表明5-氟尿嘧啶在2～100?g/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.4 精密度實驗

取5-氟尿嘧啶對照品，分別制成低、中、高3種不同濃度（5，20，80?g/mL）的對照品溶液，各連續進5次。同樣方法做3d，記錄5-氟尿嘧啶峰面積，并計算峰面積的RSD%值。見表1。

2.5 樣品測定

取生物羊膜（面積為8mm×10mm）放入2mL 5-氟尿嘧啶注射液（標示量為10mL；0.25g）中浸泡，其中生物羊膜的數量為20個，10個浸泡5min，10個浸泡10min。將羊膜取出后，加流動相1.0mL，漩渦混勻2min，離心，取上清液，進樣20μL，記錄峰面積。記錄峰面積帶入上述方程中，求得羊膜吸收的量。見表2。

3 討論

3.1 流動相的選擇

根據5-氟尿嘧啶的物理和化學性質（即5-Fu在水中略溶，在乙醇中微溶，在氯仿中幾乎不溶，在稀鹽酸或氫氧化鈉溶液中微溶）初步選定流動相為甲醇-水。又以各種體積比的甲醇-水（2︰98，5︰95，10︰90，15︰85，20︰80）進行色譜實驗，結果發現，當以2︰98甲醇-水作為流動相時，所得5-氟尿嘧啶的峰形，峰高最佳。故最終選擇2︰98的甲醇-水作流動相[6-8]。

3.2 5-氟尿嘧啶的提取

文獻報道，對5-氟尿嘧啶的提取應用乙酸乙酯提取，離心取上清液，吹干后復溶[9-10]。本實驗發現，當羊膜在注射液中浸泡后，用流動相提取的效果比乙酸乙酯提取的效果好，峰面積更大，故本次試驗5-氟尿嘧啶的提取用流動相，此法簡便，省時。

3.3 羊膜吸收量與浸泡時間

本實驗所得結果，浸泡5min的羊膜吸收5-氟尿嘧啶的量比浸泡10min的羊膜吸收的5-氟尿嘧啶的量少，說明羊膜吸收量與浸泡時間相關。但由于羊膜數量較少，未能計算出精確的比例關系，若想進一步求證，還需較多數量的羊膜進行試驗。

3.4 藥物復合型羊膜的應用前景

羊膜抗原性甚微[11-12]，同時具有清除炎性細胞，減輕炎癥反應和血管化的作用，可以減少創面的瘢痕增生[12-13]。利用羊膜的生物學特點，通過生物工程技術手段，人為改變羊膜特定的結構（去羊膜上皮細胞或改變上皮細胞性質）及成分（吸附特定的藥物，使羊膜原有化學成分發生變化），使其在保持羊膜基本生理特性的同時賦予其更多的生物學功能，我們稱其為羊膜的生物學改良，過去已經有關于羊膜吸附氧氟沙星等藥物的報道[14-15]。 新鮮羊膜通過冷凍干燥技術、鈷60輻照滅菌等操作步驟制成生物羊膜，是一種透明的、有一定韌性且無神經、血管和淋巴管的組織，保持了羊膜原有的組織結構、原有的基本化學組成、適用于臨床要求的組織韌性和生理pH值、含水量低適于常溫長期保存。經過對生物羊膜的超微結構研究發現，羊膜基底膜富含膠原纖維和網狀纖維，交織排列成網狀，網孔間隙約0.5～15?m[8]，能容納大量藥物 ，可吸附藥液作為“藥庫”，且因膠原降解時間較慢，所以可在較長時間內逐步釋放出藥物，并維持較長時間，同時維持局部有效藥物濃度，成為良好的膜控半定量釋藥系統。任何微粒大小小于生物羊膜微孔的物質均能被儲存其中。我們將生物羊膜置于25g/L 5-Fu溶液中，生物羊膜中也就儲存了一定數量的5-Fu，本實驗結果也顯示，生物羊膜可以吸附一定量的5-Fu，同時羊膜吸收量與浸泡時間相關。因此，我們認為在能夠將這種藥物復合型的羊膜應用到小梁切除術中，生物羊膜在鞏膜瓣下被逐漸的溶解和吸收，儲存其中的5-Fu被逐漸的稀釋和釋放出來，與生物羊膜一起發揮抑制濾過通道細胞增殖的作用，因此可以認為生物羊膜在本研究中起到了“天然緩釋裝置”的作用。這將大大提高青光眼手術的成功率。

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（收稿日期：2015-10-19）