實時熒光定量PCR技術在環境領域研究探討

周震宇，顏智勇

(1 湖南農業大學資源環境學院，湖南　長沙　410128；2 湘潭市環境保護科學研究院，湖南　湘潭　411104)

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實時熒光定量PCR技術在環境領域研究探討

周震宇1,2，顏智勇1

(1 湖南農業大學資源環境學院，湖南長沙410128；2 湘潭市環境保護科學研究院，湖南湘潭411104)

實時熒光定量PCR技術實現了核酸的定量，具有靈敏性高，特異性強的特點。本文從實時熒光定量PCR技術的原理，實時熒光定量PCR技術的優點與缺陷，以及熒光定量PCR技術在國內外環境領域的應用情況對熒光定量PCR技術進行探討，以期使熒光定量PCR技術在環境領域有著更合適的應用。

實時熒光定量PCR技術；優點與缺陷；應用情況；研究探討

實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real time fluorescent quantitative PCR，Real-time PCR)技術是由美國應用生物系統(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。該技術的推出實現了PCR以往只能定性分析而無法定量分析的瓶頸，與常規PCR相比，實時熒光定量PCR技術具有自動化程度更高、特異性更強、能夠快速有效解決PCR易污染問題等特點，使得其已在生物技術、醫藥技術、環境技術等領域得到廣泛應用。

1　實時熒光定量PCR技術的原理

在實時熒光定量PCR技術中，它是基于熒光共振能量轉移的基礎而形成的。熒光共振能量轉移的原理是，當一個熒光分子(即分子供體)的熒光光譜的另一分子(即分子受體)和供體熒光團的激發光譜重疊的熒光強度相同的熒光分子是與熒光強度的衰變分子會增加[1]。Ct值表示周期為每個管的熒光信號達到限制值的數目所經歷的循環數。實時熒光定量PCR中的Ct值是一個非常重要的因素，C代表循環(Cycle)，t代表閾值(Threshold)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小[1]。通過使用已知的初始拷貝數的標準品可做出標準曲線，所以，依據熒光探針的發光基團所發出的熒光強度與PCR產物的數量存在對應關系，因此只需對熒光信號進行“實時”檢測并獲得未知樣品的Ct值，獲得的熒光信號的值可以從項目的拷貝樣品數的標準曲線來計算。

相比于常規PCR，實時熒光定量PCR用于改變在熒光信號的實時監測PCR反應的擴增產物的過程中循環，模板的初始量可以定量分析。簡言之，實時熒光定量PCR技術的基本原理增加樣品核酸由相同的系統和反應條件的指數擴增，正比于產品的對數擴增樣品的DNA含量，因為該系統的用于著色或傳播的響應結合的熒光標記(熒光探針)的熒光的光產率正比于所用的核酸樣品的量進行檢測的擴增產物的量就可以通過熒光的量來確定[1]。

2　實時熒光定量PCR技術的優勢與缺陷

2.1實時熒光定量PCR技術的優勢

與傳統的PCR技術相比，實時熒光定量PCR技術有了更多的改進之處，具體如下[2]：

(1)實時熒光定量PCR實現了核酸的定量化研究，極大的擴展了PCR技術在各個領域的應用；

(2)實時熒光定量PCR技術的核酸對于檢測目標核酸具有很高的靈敏度：科爾布(Kolb)等[3]使用實時熒光定量PCR技術來檢測環境中的甲烷氧化細菌(Methane oxidizing bacteria)的數量，檢測極限能夠實現10 cells/樣品[4]；

(3)實時熒光定量PCR技術可以在一個大范圍內的檢測目標核酸數量，簡便快捷：對靶DNA的實時熒光定量PCR的標準曲線，通常可以超過7個數量級以上；

(4)實時熒光定量PCR技術安全性高：在樣品的定量檢測在PCR反應完成后，沒有進一步的后續處理，減少了工作量，以除去使用的溴化乙錠(ethidium bromide，EB)等誘變風險的過程。

2.2實時熒光定量PCR技術的缺陷

實時熒光定量PCR技術是一種高效，靈敏，安全的分子生物學手段，已經成為主流定量核酸的技術之一，但此技術還不是很成熟，在使用過程中還存在一些缺陷，具體如下[1-3]：

(1)核酸熒光標記是無法客觀地區分目標核酸和非目標核酸的，這會對實驗結果的準確性有一定的影響；

(2)標準曲線制作過程是非常復雜的，目前還沒有統一的標準方法，這將在一定程度上使得研究人員對各種調查結果缺乏可比性；

(3)許多一定數量的核酸在體內的拷貝數不明確，目前的大多數研究是基于平均份數進行評估，其精度是可疑的；

(4)設計熒光探針和分子信標是十分復雜的技術，目前在我國還沒有廣泛的應用基礎；

(5)實時熒光定量PCR技術所需的基本實驗條件和實驗費用都相比普通PCR有著較高的要求[3]。

2.3實時熒光定量PCR技術的應用

實時熒光定量PCR技術已經被廣泛應用于醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究的各個領域。大量的資料顯示，熒光定量PCR技術已經被廣泛應用于環境領域。Tay[4]利用特異性16S rDNA引物擴增自養黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)和分枝桿菌(Mycobacterium)兩種甲苯降解菌來檢測環境微生物在河流隨季節的變化情況。Grüntzig V[5]通過對反硝化亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)的定量來研究施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)種類的豐度，說明了該種微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用實時熒光定量PCR技術對湖泊中微囊菌和項圈藻微囊藻素合成酶E拷貝數進行定量，表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌產生的。Cummings[7]利用熒光定量PCR技術對沿湖泊重金屬污染濃度梯度中的還原鐵離子泥土桿菌(Geobacteraceae)家族的豐度進行了定量，發現分布相對均勻，泥土桿菌家族的分布基本與重金屬離子濃度的影響無關。Hall S J[8]通過采用熒光定量PCR技術對污水處理廠的活性污泥中的Nitrospiraspp進行了監測和定量分析。Harms G[9]通過熒光定量PCR對城市污水處理廠MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化細菌(Ammoniaoxidizingbacteria，AOB)的總量進行了定量監測。

在國內熒光定量PCR技術在環境領域的應用也是越來越廣泛。李光偉等[10]通過實時熒光定量PCR對五氯苯酚(Pentachlorophenol，PCP)好氧顆粒污泥中氨氧化細菌的定量分析進行監測，研究表明五氯苯酚對氨氧化細菌的數量影響不大，并且氨氧化細菌的數量與氨氮的去除率無直接關系。李磊等[11]通過實時熒光定量PCR對A2/O短程硝化反硝化系統內的氨氧化菌進行了定量分析，結果表明隨著亞硝酸鹽積累率的上升，系統內氨氧化細菌的數量也在大幅度上升并且亞硝酸鹽積累率的下降相對于AOB菌群數量的下降有一定的滯后性。謝潤欣等[12]對城市污水中病原性大腸埃希氏菌毒力基因eaeA和rfbE進行實時熒光定量PCR檢測，表明污水二級處理對這兩種毒力基因的去除效果明顯。李曉巖等[13]利用熒光定量PCR檢測腺病毒氣在大氣中的相對基因拷貝數，表明重組腺病毒氣溶膠主要分布在采樣器的第五級，腺病毒氣溶膠與粒子相比較大。何恩奇等[14]利用熒光定量PCR方法對產毒微囊藻mcyA基因進行了定量的分析，實現了產毒微囊藻的快速定量監測分析。

3　結　語

實時熒光定量PCR技術自產生至今已在環境領域有了廣泛應用，具有靈敏度高、檢測范圍寬、操作安全等優勢，也有不能統一標準曲線、分子信標設計十分復雜等缺陷[15]，但是隨著科學技術的進一步發展和完善，熒光定量PCR技術的優勢會更加明顯，其缺陷也必將會得到解決，熒光定量PCR技術也會有更大的完善，更廣泛的應用。

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Study on Real Time Fluorescent Quantitative PCR Technology on Environmental Area

ZHOUZhen-yu1,2，YANZhi-yong1

(1 College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128;2 Xiangtan Municipal Research Institute of Environmental Protection, Hunan Xiangtan 411104, China)

Real-time fluorescent quantitative PCR developed in the base of PCR technique as one kind of quantitative techniques about nucleic acid with high sensitivity and strong specificity. The principle of real-time fluorescence quantitative PCR technology, advantages and disadvantages of real-time fluorescence quantitative PCR technology, application and fluorescence quantitative PCR technology at home and abroad on the fluorescent quantitative PCR technology were studied in order to make the fluorescent quantitative PCR technology be applied more appropriate.

real-time fluorescent quantitative PCR; advantages and disadvantages; application; study research

周震宇(1982-)，男，工程師，從事環境影響評價、環境工程治理、環境監理工作。

顏智勇。

O657

A

1001-9677(2016)012-0153-02