食品中黃曲酶毒素的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

錢(qián)天元，單海峰，饒桂維

(1 浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015；2 瑞安市人民醫(yī)院制劑室，浙江 瑞安 325200)

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食品中黃曲酶毒素的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

錢(qián)天元，單海峰，饒桂維

(1 浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015；2 瑞安市人民醫(yī)院制劑室，浙江 瑞安 325200)

黃曲霉毒素是Ⅰ類(lèi)致癌物，通過(guò)食品或者飼料危害人類(lèi)及動(dòng)物的健康安全。充分認(rèn)識(shí)該毒素的性質(zhì)，準(zhǔn)確快速的檢測(cè)食品中黃曲酶毒素是控制其危害的最有效手段。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)有了極大進(jìn)步，本文對(duì)目前食品中黃曲酶毒素的各種檢測(cè)方法如薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相法(HPLC)、微柱篩選法(MS)、免疫傳感器、激光誘導(dǎo)熒光法、快速檢測(cè)卡法、高波長(zhǎng)法等方法的原理、應(yīng)用和各自特點(diǎn)進(jìn)行了綜述。并對(duì)各檢測(cè)方法進(jìn)行了展望。

黃曲霉毒素；檢測(cè)方法；食品安全

黃曲霉毒素(AFT)為二親呋喃香豆素的衍生物，主要由黃曲霉寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，存在于土壤和動(dòng)植物體內(nèi)。在各種堅(jiān)果，尤其是大豆、小麥、玉米和花生等糧油產(chǎn)品中最易受污染。黃曲霉毒素是霉菌毒素中毒性最大，對(duì)人類(lèi)健康危害極為突出的一類(lèi)霉菌毒素。黃曲霉毒素分子中的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)是產(chǎn)生毒性的重要結(jié)構(gòu)，有研究表明，黃曲霉毒素的細(xì)胞毒作用是干擾信息RNA和DNA的合成，進(jìn)而干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成導(dǎo)致動(dòng)物全身性損害，黃光琪等[1]研究指出黃曲霉毒素B1能與tRNA結(jié)合形成加成物，黃曲霉毒素-tRNA加成物能抑制tRNA與某些氨基酸結(jié)合的活性，對(duì)蛋白質(zhì)生物合成中的必須氨基酸有不同的抑制作用，從而在翻譯水平上干擾了蛋白質(zhì)生物合成影響細(xì)胞代謝。本文對(duì)近年來(lái)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，以期為黃曲霉毒素的污染控制提供參考。

1 黃曲霉毒素的檢測(cè)方法

1.1 薄層色譜法(TLC)

薄層色譜法(TLC)法是最為傳統(tǒng)的檢測(cè)黃曲霉毒素的常用方法。其原理在于樣品提取后進(jìn)行濃縮，然后通過(guò)薄層分離后在一定波長(zhǎng)下的紫外光照射，此時(shí)不同的黃曲霉毒素會(huì)產(chǎn)生不同現(xiàn)象，B1和B2會(huì)產(chǎn)生紫色熒光，而G1和G2會(huì)產(chǎn)生綠色熒光[2]。接著根據(jù)TLC板上的熒光的最低檢出量進(jìn)行定量。張鵬等用此方法測(cè)定了黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。該法對(duì)設(shè)備和試劑需求不大，費(fèi)用低，適用大量樣品的分離和篩選。

1.2 酶聯(lián)免疫法(ELISA)

酶聯(lián)免疫法(ELISA)法是利用抗體抗原反應(yīng)中的特異性和顯色反映的高效催化作用進(jìn)行結(jié)合而成的一種免疫分析技術(shù)[3]。它首先將抗原或抗體固定在在載體表面，仍然保持其免疫學(xué)的活性，再進(jìn)行酶標(biāo)記，被固定的抗原或者抗體依靠共價(jià)鍵和酶連接形成結(jié)合物，此時(shí)既要有免疫學(xué)活性又要有酶學(xué)活性。最后進(jìn)行顯色反映，酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體反映，然后再加入底物顯色液，通過(guò)顏色的深淺可以得知免疫反映的程度。廖妍彥等[4]利用此法在對(duì)黃曲霉毒素M1的測(cè)定上取得成效，該法靈敏度高、特異性強(qiáng)、干擾小且檢測(cè)成本低。

1.3 高效液相色譜(HPLC)

王恒玲等[5]利用縮合反應(yīng)將含羧基的氧化石墨烯材料和含有氨基的二氧化硅球偶聯(lián)，合成新型符合材料稱(chēng)為二氧化硅-氧化石墨烯復(fù)合物(GO-SiO2)用以作為固相萃取劑，依靠線柱后衍生-高效液相色譜法定量檢測(cè)黃曲霉毒素B1、B2。該法只需要簡(jiǎn)單的離心操作就能達(dá)到分離凈化的目的，而且可以快速的富集提取液中的黃曲霉毒素，具有簡(jiǎn)單、萃取效率高的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率在81.4%～105.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～8.6%，說(shuō)明此方法具有良好的可靠性和穩(wěn)定性。

1.4 微柱篩選法(MS)

微柱篩選法即MS法是利用甲醇-水-石油醚或者三氯甲烷提取處理樣液，微柱管內(nèi)的硅鎂型吸附劑層可以吸附樣液中的黃曲霉毒素，在一定的紫外光照下，將層析后的樣品柱與已有的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液體柱進(jìn)行比較[6-7]。如果黃曲霉毒素在測(cè)量范圍內(nèi)(約5～10 μg/kg)則會(huì)有藍(lán)紫色光環(huán)，其熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素的存在，在一定范圍內(nèi)為正比關(guān)系。如果沒(méi)有藍(lán)紫色光環(huán)則說(shuō)明未檢測(cè)到黃曲霉毒素即無(wú)法確定黃曲霉毒素達(dá)標(biāo)還是超標(biāo)。此方法僅能檢測(cè)黃曲霉毒素的總數(shù)，無(wú)法測(cè)定其黃曲霉毒素究竟是B1、B2、G1或者G2，所以對(duì)此方法進(jìn)行研究并不多。

1.5 免疫傳感器

免疫生物傳感器以免疫生物分子作為識(shí)別元件，將抗體或者抗原固定到感受器表面，發(fā)生免疫識(shí)別反應(yīng)后的免疫復(fù)合物與產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號(hào)相關(guān)聯(lián)，由換能器將其轉(zhuǎn)化為待測(cè)物質(zhì)活度有關(guān)的物理化學(xué)信號(hào)(電信號(hào)，光信號(hào)等)再通過(guò)二次放大輸出信號(hào)，進(jìn)行換算實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的檢測(cè)[8]。

方銀軍等[9]將氧化石墨烯、2,5-二(2-噻吩)-1-對(duì)苯甲酸吡咯和氯金酸一次電沉積于金電極表面，再用1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二壓胺鹽酸鹽/N-羥基丁二酰亞胺作為活化劑，將黃曲霉毒素B1抗體與到點(diǎn)高分子模的羧基共價(jià)鍵合，最后用1,3-二正丁基咪唑六氟磷酸鹽離子液體作為修飾電極表面的溶液。此方法的靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性都優(yōu)于現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道，可以用于實(shí)際樣品的痕量測(cè)定。實(shí)際測(cè)試中的加標(biāo)回收率在97.2%～106.8%具有較高的準(zhǔn)確度。

1.6 加壓毛細(xì)管電色譜-激光誘導(dǎo)熒光法(pCEC-LIF)

加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)是一種新興的微分離技術(shù)，有著卓越的高柱效、高選擇性、高分辨度、快速分離及樣品和試劑用量少的特點(diǎn)[10]。但是由于重現(xiàn)性不足，這在一定程度上制約了其發(fā)展，萬(wàn)青云等[11]使用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIF)與pCEC儀器聯(lián)用建立了黃曲霉毒素檢測(cè)方法。在實(shí)際樣品測(cè)量中，加標(biāo)回收率在90%～112%有較高的準(zhǔn)確性。該方法提高了分析速度、分離能力、檢測(cè)的靈敏度，而且樣品用量只需要10-9L，適用于痕量檢測(cè)，既減少了浪費(fèi)又節(jié)約了檢測(cè)成本，具有較高的推廣價(jià)值。

1.7 黃曲霉毒素快速檢測(cè)卡

快速檢測(cè)卡基于免疫膠體金技術(shù)，利用氯金酸在還原劑的作用下，會(huì)聚合成一定大小的金顆粒，形成帶有負(fù)電的疏水膠體溶液[12]。

拜發(fā)公司提供的Aflacard B1和Afllacard Total速測(cè)卡可以用于黃曲霉毒素B1和B2的定性或半定量檢測(cè)，Aflacard B1檢測(cè)限度為2、5、10、15 ng/g，而Afllaccard Total則可以檢測(cè)黃曲霉毒素的總量，限度為4～30 ng/g[13]。其中每條快速檢測(cè)卡可以同時(shí)對(duì)2份樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)目測(cè)對(duì)面質(zhì)控線和檢測(cè)線的顏色變化，從而直接得知樣品中的黃曲霉毒素的存在情況。在不配備儀器等條件下，在30 min內(nèi)可以獲得結(jié)果，使用后的檢測(cè)卡應(yīng)該置于黑暗處，可以進(jìn)行長(zhǎng)期保存。其中卡盒在2～8 ℃可穩(wěn)定保存6個(gè)月左右，其制造成本不高，一個(gè)樣品的檢測(cè)費(fèi)用僅在幾十元左右。

1.8 高光譜最優(yōu)波長(zhǎng)及費(fèi)希爾(Fisher)判別分析法

褚璇等[14]發(fā)現(xiàn)高光譜技術(shù)具有快速、非破壞、像素級(jí)信息獲取等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)一臺(tái)高靈敏度相機(jī)，一臺(tái)高光譜儀，一個(gè)蔡司透鏡和2個(gè)500 W的鹵鎢燈組成可以采集400～1000 nm范圍的反射光譜儀器。圖像用ENVI遙感圖像處理平臺(tái)進(jìn)行處理，將玉米顆粒上滴有黃曲霉毒素溶液的地方選擇為感興趣區(qū)，得出像素點(diǎn)在各波長(zhǎng)下的平均反射率，再通過(guò)Matkab2012軟件進(jìn)行分析處理，然后通過(guò)費(fèi)希爾判別法(Fisher)以最小誤判率為標(biāo)準(zhǔn)，建立以所選最優(yōu)波長(zhǎng)為輸入變量的判別模型。該方法驗(yàn)證五種不同濃度黃曲霉毒素的玉米顆粒判別正確率可以達(dá)到80.9%具有價(jià)高的準(zhǔn)確性。可作為識(shí)別田間霉變農(nóng)作物黃曲霉代謝產(chǎn)生毒素的技術(shù)基礎(chǔ)。

2 展 望

黃曲霉毒素種類(lèi)繁多，有B1、B2、G1和G2還有衍生的M1、M2等等，毒性強(qiáng)。所以為了避免黃曲霉毒素的污染造成的人員和經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)該阻斷其進(jìn)入人類(lèi)的食物鏈，其次把控好檢測(cè)這道管卡，活用以上的檢測(cè)方法杜絕黃曲霉毒素污染的食品進(jìn)入社會(huì)。

(1)快速檢測(cè)卡法其操作步驟簡(jiǎn)便易懂，而且具有快速，靈敏度高，有極強(qiáng)的特異性，且比較穩(wěn)定，對(duì)儀器的依賴(lài)性低，制作成本低廉等各種優(yōu)點(diǎn)。此方法的普及性遠(yuǎn)超其它檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，但其準(zhǔn)確度和精確度并不能令人感到滿(mǎn)意，需要改進(jìn)研究。

(2)電化學(xué)免疫傳感器將化學(xué)和物理，生物等知識(shí)進(jìn)行多方面的結(jié)合，具有多方面的優(yōu)點(diǎn)，而且可以進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)對(duì)大型分析儀器的依賴(lài)性低，在線檢測(cè)是今后黃曲霉毒素分析檢測(cè)方法實(shí)踐的主要思路。

(3)加壓毛細(xì)管電色譜等現(xiàn)代儀器的檢測(cè)方法應(yīng)該更多的去探究，爭(zhēng)取找出更容易普及，而且測(cè)定準(zhǔn)確，測(cè)定環(huán)保的檢測(cè)方法。

(4)高光譜及fisher判別分析法，更多的去運(yùn)用數(shù)學(xué)中的一些模型，算法以彌補(bǔ)儀器上的一些不足。

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Research Progress on Detection of Aflatoxins in Food

QIANTian-yuan1,SHANHai-feng2,RAOGui-wei1

(1 College of Biology and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Zhejiang Hangzhou 310015;2 Department of Pharmacy, The People’s Hospital of Ruian, Zhejiang Ruian 325200, China)

Aflatoxins are the carcinogens of typeⅠ. They are dangerous to human and animal’s health and safety through food or feed chains. The most effective method to control its negative impact is to fully understand their characteristics for conducting accurate and rapid detection. With the development of science and technology, great progress has been made in the detection of aflatoxin. The detection methods, such as thin layer chromatography (TLC), enzyme-linked immunoassay(ELISA), HPLC, micro column screening(MS), immunosensor, laser induced fluorescence method(LIF), quick measure car and hyperspectral optimum wavelengths method, were reviewed. The prospect of the detection methods was also discussed.

aflatoxin；detection method；food safety

浙江樹(shù)人大學(xué)2015年度中青年學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目。

錢(qián)天元(1996-)，男，浙江海寧人，從事色譜檢測(cè)工作。

饒桂維(1979-)，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品檢測(cè)。

TS207.4

B

1001-9677(2016)022-0006-03