膜微粒在肝臟疾病中的研究進展

陳　俊　李良平

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膜微粒在肝臟疾病中的研究進展

陳俊李良平

膜微粒是細胞活化、凋亡早期、應力作用時釋放的一類富含脂類、蛋白質、核酸的細胞膜包裹的顆粒，其組成與母體細胞的來源和釋放機制密切相關。不同細胞來源的膜微粒內含物并不完全一致，生物學功能與疾病發生發展的關系也各有異同。近年來研究發現，無論是在生理作用與機制方面，還是在疾病發生發展與臨床診治方面，膜微粒都占有十分重要的作用和地位。此文就膜微粒及其在肝臟疾病中的研究進展作一綜述。

膜微粒；非酒精性脂肪性肝炎；急性肝損傷；肝纖維化；肝細胞癌

膜微粒(MP)是一類廣泛存在于細胞培養上清液以及各種體液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，直徑為0.1～1 μm，富含蛋白質、脂類、mRNA、miRNA、DNA的細胞膜包裹的顆粒[1-3]。紅細胞、白細胞、內皮細胞等大多數真核細胞都能在應激、凋亡或者應力的作用下釋放MP。目前研究認為MP是亞細胞水平信息傳遞的載體，是一種新的細胞間信息傳遞機制。既往對MP的研究主要集中在凝血、血管性疾病、某些傳染性及自身免疫性疾病方面。近年來國外研究發現，在各類肝臟疾病中MP的釋放也會增加，并可能參與了細胞間通訊、細胞遷移、血管新生和免疫調節等過程，認為MP很有可能成為這類疾病的診斷標志物及治療靶點。本文就MP與肝臟疾病關聯性的研究進展作一簡要綜述。

1　MP的定義

1967年，Wolf首次發現在活化的血小板周圍存在一些具有促進凝血的顆粒，并將其命名為“血小板塵埃”(platelet dust)[4]。之后對MP的研究進展緩慢，且一直沒有關于MP的精確定論。近年來運用流式細胞術、電子顯微鏡和動態光散射技術，人們才逐漸了解到MP的特征。學者們將在組織及體液中觀察到的由細胞膜包裹的囊泡狀物統稱為細胞外囊泡(EV)[5]，它們是一種母體細胞來源的亞細胞結構，由死亡或活化的細胞釋放。目前發現有兩種類型的EV，包括外泌體(EXO)和MP或者微泡(MV)(目前認為MP與MV是同一種物質的不同表述方式[6])。實驗中主要根據大小、密度、產生方式來區分EXO和MP，具體如下：EXO直徑<100 nm，密度1.13～1.19 g/mL，由內體性溶酶體作用產生[7]；MP直徑100～1000 nm，由質膜“出芽”形成，膜表面表達凋亡標志物，能被膜聯蛋白V(Annexin V)標記[8-9]。人們常說的凋亡小體(apoptosis body)，是胞膜皺縮內陷，分割包裹胞質形成的泡狀小體，內含DNA及細胞器，直徑為1～4 μm[9]，并不屬于EV的范疇。

2　MP的形成機制

微粒的脫落是所有真核生物受到刺激或凋亡時的一個原始應激反應，但其具體形成機制十分復雜，可能是多因素疊加的結果。大部分研究認為當受到炎性反應、凋亡刺激時，細胞骨架重構，MP以“出芽”方式產生，以胞吐的形式釋放到細胞外，其產生受細胞內Ca2+和細胞骨架相關酶的調節[10]。正常細胞膜的磷脂雙分子層是由外層的磷脂酰膽堿和鞘磷脂與內層的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸(PS)組成。細胞活化過程中，活化誘導物使Ca2+聚集，抑制或降低轉位酶等多種酶的效能，繼而PS與磷脂酰乙醇胺不能被轉運至細胞內膜，最終導致細胞膜的脂質雙分子層發生不對稱重排，PS暴露于細胞膜外側。同時相對升高的Ca2+濃度可使細胞骨架蛋白斷裂并發生重構，質膜向細胞外突出形成“出芽”并脫落，形成MP[11]。細胞凋亡與天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)和Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)有關。在凋亡途徑中，MP的形成依賴于ROCKⅠ和caspase-3的激活，ROCKⅠ主要作用于肌球蛋白輕鏈和肌動蛋白，肌球蛋白輕鏈磷酸化加快并與肌動蛋白相互結合，引起細胞收縮并釋放MP[12]。質膜“出芽”過程中包裹了一定的細胞質，富含脂質、蛋白質、核酸等多種細胞成分，研究推測這些成分并不是隨機包裹進來的，而是在疾病特定的病理生理過程中生成的。

3　MP發揮生物學效應的途徑

MP豐富的細胞表面分子(如膜結合蛋白、膜錨定受體、黏附分子、細胞表面特異抗原等)和內含物(細胞因子、趨化因子、生長因子、信號通道蛋白等蛋白質及RNA、miRNA、DNA)構成了其發揮生物學效應的基礎。研究顯示MP可能通過以下兩種途徑發揮作用[6]：(1)抗原抗體反應直接激活受體細胞。MP表面抗原分子與受體細胞表面抗體結合，激活受體細胞，啟動相應的信號轉導通路，產生應答國。(2)MP搭載的內容物改變受體細胞功能表達。MP與目的細胞融合或直接釋放其內容物，影響細胞表型及基因的表達，使受體細胞功能發生改變，即完成信息的傳遞。值得注意的是，MP不止停留于起源細胞的周圍，也可以隨血液循環遷徙至全身各處[13]，因此，MP以上兩種信號轉導途徑不僅可影響其周圍細胞，還可以調節遠離起源細胞的組織細胞。鑒于以上作用，可以認為MP不僅可作為疾病的檢測指標，還可作為疾病的治療靶點。

4　MP的檢測方法

MP作為一群細胞亞結構能穩定存在于多種體液內[14]，體外反復超速離心或凍融均不影響其形態大小，但4℃或37℃保存可能導致MP結構降解[15]。MP可通過多步差速離心法從樣本中分離，常規透射電鏡或負染透射電鏡可觀察MP的大小和形態[16]；通過蛋白質組學分析，可以確定MP的蛋白質組成[17]；流式細胞術通過Annexin V錨定PS，并聯合熒光素標記的高特異性抗體結合MP上的特異性標志物，可以分析微粒的大小和形態、膜表面特異的抗原分子以及內含物[18]；甚至可以通過ELISA方法初步檢測MP[19]。

5　MP在肝臟疾病中的研究進展

肝臟損傷是各類細胞間相互作用的結果，而MP恰巧就是這些細胞間信息傳遞的媒介。近年來的研究主要集中在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、急性肝損傷、肝纖維化、肝細胞癌等疾病過程。

5.1MP與NASH

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)與肥胖、糖尿病、血脂異常、高血壓相關，是代謝綜合征的肝臟表現形式。NAFLD包括非酒精性脂肪肝(NAFL)和NASH[20]。肝臟過多攝取游離脂肪酸造成的脂質沉積是NASH發展的中心環節。脂毒性引起的病理性血管形成是肥胖相關慢性肝臟炎性反應發生的關鍵病理過程[21]，肝細胞釋放的MP可能是NASH肝臟脂毒性和炎性反應的橋梁。最近一項研究指出，過度飽和脂肪酸沉積的小鼠肝細胞釋放MP，MP數量與炎性反應嚴重程度相關，MP表面的血管非炎性蛋白-1(Vanin-1)介導MP進入血管內皮細胞并將其激活，導致內皮細胞遷徙和病理性血管形成[13]。Vanin-1包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)，與細胞間黏附和遷徙有關，Vanin-1介導MP在血管內皮細胞的內化中發揮了“脂質筏”的作用。同樣，Povero等[16]研究NASH小鼠，發現MP水平與肝細胞凋亡、纖維化和新生血管形成有關。Spearman相關性分析指出，MP水平與細胞凋亡(r2=0.64，P<0.05)、肝纖維化程度(r2=0.66，P<0.05)、新生血管(r2=0.71，P<0.05)相關，其水平隨肝臟損傷程度加重而升高。

有研究報道，通過特定免疫細胞來源的MP定量，可從NAFLD中鑒別NASH并判斷肝臟炎性反應程度。正常肝組織中有多種免疫細胞，如庫普弗細胞(KC)、自然殺傷細胞(NK)和自然殺傷T細胞(NKT)。固有免疫系統的激活是發生NASH的基礎。有研究表明KC和浸潤巨噬/單核細胞、恒定自然殺傷T細胞(iNKT)在NASH的發生發展中扮演重要角色[22-24]。同時巨噬細胞在肝臟中的聚集與NASH病理分期分級有關[25]。以色列學者Kornek等[26]采集慢性丙型肝炎(CHC)、NAFL、NASH患者及正常對照組外周靜脈血，通過流式細胞術分析MP表面抗原并計數，指出CD14+和iNKT MP與丙氨酸氨基轉移酶(ALT)升高相關，Spearman相關系數分別為0.63和0.59，并且兩者也均與組織學炎性反應程度相關(r=0.58，P<0.000 1)，但與纖維化分級無關。因此，檢測CD14+和iNKT MP可診斷NASH。

NAFLD與肥胖密切相關，肥胖導致代謝綜合征的中心事件是脂肪組織巨噬細胞浸潤。Eguchi等[27]指出，暴露于飽和脂肪酸的脂肪細胞釋放高水平MP，引導單核和巨噬細胞募集于脂肪組織。進一步研究表明，從ob/ob小鼠分離MP，靜脈注射到野生型小鼠中，在脂肪組織和外周循環中均可觀察到單核細胞活化。Koeck等[28]研究發現，肥胖患者的內臟脂肪可釋放MP和EXO，兩者可整合到肝星狀細胞中，導致轉化生長因子-β(TGF-β)參與的信號通路失調，為研究NAFLD的發病機制提供了新的思路。

5.2MP與急性肝損傷

CD39，即是胞外核苷三磷酸雙磷酸酶1(E-NTPDase1)，能水解胞外三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)為一磷酸腺苷(AMP)和游離的磷酸。表達CD39+的活性MP可調節白細胞和內皮細胞的信息交換[29]。以往研究認為，缺失CD39會嚴重影響血管形成和肝組織再生，不利于急性肝損傷的肝臟修復[30]。近期研究指出，急性肝臟損傷時，造血干細胞(HSC)釋放CD39+、CD133+MP進入肝臟，減輕血管炎性反應并促進肝組織再生修復，且HSC和CD133+MP發揮作用均依賴于CD39+MP。同時，研究還納入急性肝損傷、慢性肝損傷急性加重患者進行臨床試驗，發現急性肝損傷時CD39+MP明顯升高，而CD39+/CD133+MP在慢性肝損傷急性加重患者中明顯升高，兩者均與血管內皮細胞黏附分子(VCAM-1)、白細胞介素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)顯著相關[31]。因此，CD39+MP、CD133+MP可用于評估急性肝損傷患者病情，甚至可評估肝移植的時機。肝切除或移植引起的缺血再灌注(IRI)可導致氧化應激發生，進一步損傷肝竇內皮細胞，導致KC再生、血小板活化和微循環障礙。Teoh等[32]的研究認為，肝臟發生IRI時，血漿中各類細胞來源的MP釋放量明顯增多，MP通過促炎效應和活化血小板參與IRI的病理過程。MP的促炎特性如下：激活核因子-κB(NF-κB)和JNK激酶，使黏附分子E-選擇素(E-selectin)、P-選擇素(P-selectin)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和VCAM-1高表達。而當加入Annexin V的同源二聚體Diannexin(ASP8597)時，觀察到肝臟炎性反應減輕。Diannexin不僅可抑制血栓形成[33]，還可終止肝臟氧化應激級聯反應。

5.3MP與肝纖維化

肝竇內皮細胞毛細血管化先于其他肝血管重組的發生，并引起血液分流，形成血管通道，最終產生肝纖維化。Hedgehog(Hh)信號通路激活與脂肪性肝炎和纖維化相關，與匯管區炎性反應密切相關[34]。Witek等[35]從膽管結扎大鼠的血液、膽汁中分離得到MP，第1次證明了肝細胞來源的MP可存在于肝纖維化大鼠的血液和膽汁中。研究進一步指出，肝纖維化模型中肝星狀細胞釋放大量生物活性MP，這種MP帶有Hh信號通路的配體，以MP為轉運載體，激活肝竇內皮細胞，改變相關基因的表達，導致肝竇毛細血管化，促進肝纖維化進展，這與既往研究結果相符[36-37]。所以攜帶Hh信號通路配體的MP可介導肝竇毛細血管化和肝纖維化。Kornek等[38]的研究指出，CD4+MP、CD8+MP在CHC患者外周血中明顯升高，與肝臟組織學評分相關。研究進一步指出通過細胞間黏附分子-1(ICAM-1)作用，CD4+MP、CD8+MP與肝星狀細胞的細胞膜融合，其攜帶的信號分子CD147(EMMPRIN，細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子)激活細胞內NF-κB和細胞外信號調節激酶(ERK)1/2通路，上調肝星狀細胞致纖維化基因的表達。此外，Rautou 等[39]進行的一項綜合離體及活體研究發現，血漿MP可減輕肝硬化門脈高壓，MP使血管收縮性降低，血壓降低，促進與門脈高壓有關的動脈血管擴張，其中COX-1及MP表面的PS參與以上生理過程。同時研究還發現肝硬化患者血漿內皮細胞(CD31+/CD41-)MP、全白細胞(CD11a+)MP、T細胞(CD4+)MP、紅細胞(CD235a+)MP明顯升高，其中肝硬化程度與CD31+/CD41-MP水平顯著相關。

5.4MP與肝細胞癌

越來越多的研究表明，MP在誘導細胞凋亡方面具有重要作用。Sarkar等[40]發現，單核細胞來源的MP可通過傳遞caspase-1誘導目標細胞凋亡。內皮細胞、血小板來源的MP含有caspase-3[41-42]。腫瘤細胞來源的MP攜帶Fas配體(FasL或CD95L)，導致具有Fas受體的淋巴細胞凋亡[43]。腫瘤細胞分泌微粒(TMV)參與腫瘤進展的多個方面，TMV向周圍的普通細胞傳遞腫瘤特異性蛋白而改變細胞表型，傳遞核酸而改變細胞功能，增加逆轉錄干擾基因的穩定性，從而建立腫瘤微環境[44]；同時，MP可促進血管新生、破壞細胞基質，從而增強腫瘤細胞的侵襲性。另外，有研究指出肝細胞癌化學治療的高耐藥性與MP有關。Takahashi等[45]證實了MP內含的長鏈非編碼RNA(lincRNA)參與了基于TGF-β的耐藥過程。lincRNA-ROR(linc-ROR)是一種在腫瘤細胞中高表達的競爭性長鏈非編碼RNA，在腫瘤細胞來源的MP中的含量也較豐富。腫瘤細胞釋放MP，并高表達linc-ROR，改變目標細胞功能，使細胞對化學治療藥物敏感性降低。大多數腫瘤細胞表達CD133+，而CD133+原始腫瘤細胞對化學治療藥物的應答較差[46]，研究觀察到TGF-β可使CD133+細胞增多，并在培養基中呈菌落生長，若加入linc-ROR抑制劑，可削弱上述效應。

6　展望

MP在肝臟疾病發生發展過程中發揮重要作用，血漿MP水平與肝臟疾病密切相關。通過分析其表面抗原、蛋白質及核酸可知，MP可能成為潛在的具有疾病特異性的生物標志物和評價療效的有效工具，根據其介導細胞與細胞間信號轉導的特征，MP可成為多種疾病治療的靶點。但MP導致疾病的機制尚不清楚，需要更深入的研究，其臨床應用前景也需要進一步探索。另外，為了更好地鑒別肝臟疾病并評估治療效果，還需要準確、簡化地測量循環中的MP，因此MP測定的標準化是未來臨床研究努力的方向。

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(本文編輯：周駿)

563003遵義醫學院(現就職于四川省醫學科學院·四川省人民醫院消化科)

李良平，Email: llp0131@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.02.007

2015-07-30)