兩種PMS肝氣逆證大鼠模型造模方法的效果比對分析＊

孫 鵬，李 倩，朱德豪，魏 盛

（山東中醫藥大學 腦行為分析實驗室 濟南 250355）

兩種PMS肝氣逆證大鼠模型造模方法的效果比對分析＊

孫 鵬，李 倩，朱德豪，魏 盛＊＊

（山東中醫藥大學 腦行為分析實驗室 濟南 250355）

目的：本文主要研究PMS肝氣逆證標準化大鼠模型的造模方法。方法：分別采用情志刺激為主擇時分段刺激造模法和情志刺激為主連續刺激造模法，制備PMS肝氣逆證大鼠模型，選擇氟西汀分散片和白香丹膠囊進行藥物干預。通過對2種造模方法所得關鍵行為學指標結果進行比對分析，篩選出最佳造模條件。結果：①擇時分段刺激造模法可以誘導大鼠的焦慮樣行為，并且在非接受期減弱、接受期加強，大鼠的各行為學指標間發生明顯的同步改變，給予臨床PMS肝氣逆證有效藥物能夠改善這一現象；與正常組相比，造模組的各項行為學指標具有統計學差異。②連續刺激造模法也可誘導大鼠的焦慮樣行為，但給予藥物干預后沒有改 善；在各項焦慮樣行為指標中，僅進入開放臂時間百分比在接受期和非接受期存在明顯變化；雖然與接受期相比，模型組大鼠非接受期進入開放臂次數和百分比下降、曠場實驗總分提高，但其結果沒有統計學差異。結論：情志刺激為主的擇時分段刺激造模法，誘導出的PMS肝氣逆證大鼠模型，更為契合PMS肝氣逆證患者臨床表現。

PMS 肝氣逆證 動物模型 造模方法

經前期綜合征（Premenstrual Syndrome，PMS）是一組周期性出現在月經周期黃體期的身體、精神和行為3方面的癥候群，并影響婦女的日常生活和工作，其中，肝氣逆證是PMS的主證之一[1,2]。近年來，PMS發病率逐漸增高，日益受到國內外醫學界的關注。課題組前期研制的情志刺激為主多因素連續造模法[3,4]制備的PMS肝氣逆證大鼠模型，已被界內普遍認可和廣泛采用。但是該方法，在大鼠的非接受期（即人的月經周期黃體期）仍進行造模應激刺激，顯然在病理病機上與臨床病患不符[5]。因此，本實驗選擇情志刺激為主多因素擇時分段刺激造模法制備PMS肝氣逆證大鼠模型，并比對分析課題組前期的連續刺激造模法，以實現PMS肝氣逆證大鼠模型造模方法的標準化，為PMS的研究提供更為準確的病癥結合動物模型。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級雌性Wistar大鼠，健康未孕，體質量160-180 g。北京維通利華實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2007-0001。

1.2 主要藥品

無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司，批號：XK1301100015）；生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司，批號：1404132143）；氟西汀分散片（禮來蘇州制藥有限公司，批號：H20050463）；白香丹膠囊（青島海川創新生物天然藥物研究中心，批號：20071020）。

1.3 主要儀器

曠場實驗箱（山東中醫藥大學腦行為分析實驗室自制）；高架十字迷宮（山東中醫藥大學腦行為分析實驗室自制）；ST-A數字脈沖生物刺激儀（濟南空軍后勤裝配總廠、山東中醫藥大學聯合研制）。

2 實驗方法

2.1 篩選動物

實驗開始之前，適應性飼養大鼠7天，條件：晝夜顛倒環境（20∶00開燈，08∶00關燈）、恒溫（23±3℃）、恒濕（60±5%RH）。選擇簡易陰道涂片鏡檢法[6]：連續8天陰道涂片、1次/天，篩選出40只動情周期規律 的大鼠進入實驗。然后適應性飼養8天（飼養條件同上），并參照Rygula R.等[7]研究，每日抓握全部大鼠，時間控制在5 min以上。暗淡燈光（＜28 lx）下進行所有實驗操作[8]。

2.2 動物分組

適應性飼養后，即實驗第9日，對動情周期規律的40只大鼠，進行糖水偏好實驗（Sucrose Preference Test，SPT）、曠場行為學（Open Field Test，OFT）、高架十字迷宮實驗（Elevated Plusmaze Test，EPM），采集相關數據，并隨機分為以下4組：正常對照組（Control）、PMS肝氣逆證模型組（Model）、氟西汀干預組（FXT）、白香丹干預組（BXD）。

2.3 動物模型制 備

2.3.1 連續刺激造模法（實驗Ⅰ）

根據本課題組前期研究結果[3]，對第一批次擬造模大鼠，從實驗第13日起，行連續5天的情志刺激為主多因素造模法。具體操作：將模型組、氟西汀組和白香丹組大鼠，置于ST-A數字脈沖生物刺激儀內，調整刺激條件：中等強度電流0.5 mA、電壓2 700-3 300 V、脈寬0.3 s、白天2檔（間隔時間5 min）、夜間3檔（間隔時間10 min）。

2.3.2 擇時分段刺激造模法（實驗Ⅱ）

結合連續刺激造模法，僅在兩個動情周期的非接受期刺激大鼠，改進操作如下：對第二批次擬造模大鼠，從實驗第13日起，行連續2天的造模刺激，接著暫停一日，然后繼續行連續2天的造模刺激。余造模條件同上。

2.4 給藥劑量和方法

各組大鼠于每日09∶00，按1 mL/100 g同時灌胃給藥，1次/日。正常組與模型組，給予等量純水。造模刺激同時，氟西汀組大鼠采用2.7 mg·kg-1·d-1氟西汀分散片灌胃干預；白香丹組大鼠給予200 mg·kg-1·d-1白香丹膠囊灌胃治療[9]。實驗Ⅱ中，在造模第15日（即非造模刺激時），予氟西汀組和白香丹組大鼠以等量純水灌胃。

2.5 行為學數據的采集與測定

分別于實驗第9日、第10日（即造模開始前2天）07∶00采集大鼠相關行為學數據，作為接受期基線（R1）、非接受期基線（NR1）；于實驗第18日、第19日（即造模結束后兩天）07∶00采集大鼠相關行為學數據，作為造模后的接受期數據（R2）、非接受期數據（NR2）[10]。具體如下：

2.5.1 糖水偏好實驗（大鼠興趣偏好缺失度考察）

參照 Pandey D.K.等研究[11]，本實驗的糖水偏好實驗，予以大鼠1 h內純水、0.8%蔗糖水溶液自由選擇，并半小時置換瓶子位置一次，以避免大鼠偏飲一側水。糖水偏好系數（Sucrose Consumption，SC）：SC%=糖水消耗/（糖水消耗+純水消耗）× 100%[10]。

2.5.2 曠場實驗（大鼠運動與探究行為[12]）

將大鼠置于曠場實驗箱最中央的方格中，3位觀測者同時記錄大鼠3 min內的直立次數和穿越底面方格次數，前者記為垂直得分（以大鼠兩前爪騰空或攀附墻壁為準），后者記為水平得分（以大鼠四爪均進入方格為準），曠場實驗總得分=垂直得分+水平得分[13]。得出各組得分情況后，盲法進行行為學評定。

2.5.3 高架十字迷宮實驗（大鼠焦慮程度考察[14]）

將大鼠置于高架十字迷宮中央平臺，3位觀測者同時記錄5 min內大鼠的如下行為學指標[15]：①進入開放臂次數（Open Arm Entry，OE）：大鼠肩部以上進入開放臂的次數；②進入封閉臂次數（Close Arm Entry，CE）：大鼠肩部以上進人封閉臂的次數；③進入開放臂時間（Open Arm Time，OT）：大鼠肩部以上進入開放臂的時間；④進入封閉臂時間（Close Arm Time，CT）：大鼠肩部以上進入封閉臂的時間，并由以上指標分別計算出：⑤大鼠進入開放臂和封閉臂的總次數（Locomotor Activity in EPM，LA in EPM=OE+CE）；⑥進入開放臂次數百分比[OE%=OE/（OE+CE）×100%]；⑦開放臂停留時間百分比[OT%=OT/（OT+CT）×100%][16]。采用盲法進行行為評定。

2.6 行為學指標的篩選

結合課題組前期經驗，選擇OFT、SPT、EPM實驗中穩定性較高、復測信度良好的行為學指標納入統計,具體指標：糖水偏好系數（SC%）、曠場實驗總分（LA）、進入開放臂次數百分比(OE%)、開放臂停留時間百分比（OT%）[17,18]。

2.7 數據統計與處理

選用GraphPad Prism 6.0統計軟件，采用單因素方差分析法,對造模后接受期與非接受期的行為學指標進行統計，組間比較用Bonferroni校正t檢驗，顯著差異水平設定為P＜0.05。

3 結果

3.1 連續刺激造模后大鼠接受期及非接受期關鍵行為學指標結果

如圖1所示，連續刺激造模后：①接受期：與模型組相比，氟西汀組大鼠SC%明顯升高（P＜0.05）；與正常組相比，模型組、氟西汀組大鼠LA明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，白香丹組大鼠OT%明顯下降（P＜0.05）；②非接受期：與模型組相比，白香丹組大鼠SC%明顯上升（P＜0.05）；與正常組相比，模型組、氟西汀組大鼠LA明顯升高（P＜0.01，P＜0.01）；與模型組相比，白香丹組大鼠LA明顯下降（P＜0.05）。余參數接受期與非接受期均未見顯著性差異（P＞0.05）。

3.2 擇時分段刺激造模后大鼠接受期與非接受期關鍵行為學指標結果

如圖2所示，擇時分段造模刺激后：①接受期：各組大鼠間，均不存在明顯差異；②非接受期：與正常組相比，模型組大鼠SC%、OT%、OE%明顯下降（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）、LA明顯上升（P＜0.001）；與模型組相比，氟西汀組大鼠SC%、OT%、OE%明顯上升（P＜0.001，P＜0.05，P＜0.01）、LA明顯下降（P＜0.001）；與模型組相比，白香丹組大鼠SC%、OT%、OE%明顯上升（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），LA則明顯下降（P＜0.01），但仍顯著高于正常組（P＜0.05）。

圖2 擇時分段刺激造模后大鼠接受期與非接受期關鍵行為學指標比較

4 討論

王俊仁[19]研究發現：在不同的動情周期刺激大鼠，會產生不同效果。課題組前期在PMS肝氣逆/郁兩證獼猴模型制備的探索中，也發現于雌性獼猴的黃體中晚期（相當于人經前期）進行擠壓造模刺激，可誘導獼猴出現與PMS臨床患者典型癥狀相類似的行為表現[20]。綜上分析，我們初步推論：僅在大鼠連續2個動情周期的非接受期進行造模刺激，大鼠可能出現PMS樣情緒改變。

前期臨床流行病學調查中，課題組已提出PMS肝氣逆證的初步診斷標準為：主證：急躁易怒、頭目眩暈、頭脹痛，兩脅竄痛、胃脘脹痛；次證：失眠多夢、吞酸噯氣、腸鳴腹瀉、月經先期、脈弦、表情亢奮。主證“急躁易怒”為必備證狀，兼有其他任何一項及以上次證者診斷為肝氣逆證[21]。針對臨床PMS肝氣逆證患者上述癥狀表現，本課題組采用SPT-OFT-EPM多種行為學方法，對動物模型進行評價。糖水偏好實驗結果顯示：①擇時分段刺激造模法在非接受期，模型組大鼠SC%水平明顯下降，予以藥物干預后，SC%水平有所上升，與臨床PMS患者抑郁樣表現類似；②采用連續刺激造模法雖出現上述變化，但不存在顯著的統計學差異。由此可見，擇時分段刺激造模法，能夠誘導PMS肝氣逆證大鼠快感缺失樣行為表現，動物實驗中這一表現往往是和焦慮樣行為伴隨產生的。曠場實驗結果發現，擇時分段刺激造模法顯示，模型組大鼠在關鍵行為學指標LA上增加極為明顯；連續刺激造模法顯示模型組大鼠在該指標上明顯增加。這提示擇時分段刺激造模法，對大鼠整體興奮性、敏感性的影響較連續刺激造模法更為明顯，行為表征上更為契合PMS臨床病患焦慮亢奮特征。高架十字迷宮結果發現，擇時分段刺激造模法顯示模型組大鼠OT%、OE%明顯降低，予以白香丹或氟西汀干預后，OT%、OE%均明顯升高；連續刺激造模法顯示，模型組和正常組大鼠OT%、OE%均低，且不存在顯著性差異。相比較而言，擇時分段刺激造模法各組大鼠在OT%、OE%等指標上存在更為顯著的差異，證實該方法可成功誘導大鼠焦慮樣行為，這一行為的意義與臨床患者出現的急躁易怒情緒行為是等同的。

綜合上述實驗結果，再次證實我們上面的推論：僅在大鼠連續兩個動情周期的非接受期進行造模刺激，制備的PMS肝氣逆證大鼠模型，大鼠的行為學表現，更類似于臨床患者中出現的性情急躁易怒、緊張亢奮、焦慮等癥狀。

同時，我們還發現，擇時分段刺激造模法可以誘導大鼠焦慮樣行為的出現，并且在非接受期減弱、接受期增強，大鼠各行為學指標間發生同步改變，臨床PMS肝氣逆證有效藥物能夠改善這一現象；相比于正常組，模型組的各項行為學指標具有明顯差異。連續刺激造模法同樣可以誘導上述現象的出現，但不能被藥物所糾正；焦慮樣行為指標中，僅OT%在接受期和非接受期存在明顯變化；雖然與接受期相比，模型組大鼠非接受期OE%下降、LA上升，但其結果不存在顯著的統計學差異。

綜上所述，擇時分段刺激造模法制備的PMS肝氣逆證大鼠模型，其類臨床癥狀的一組行為學指標統計學差異明顯；而連續刺激造模法制備的模型，只有一部分行為指標有輕微變化，無統計學意義。因此，制備PMS肝氣逆證大鼠模型，較之擇時分段刺激造模法，情志刺激為主擇時分段刺激造模法所誘導的模型，與PMS肝氣逆證患者臨床表現更為契合。

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Comparing and Analyzing Effects of Two Modeling Methods on PMS Liver-Qi Invasion Rat Model

Sun Peng, Li Qian, Zhu Dehao, Wei Sheng
(Laboratory of Behavioral Brain Analysis, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

This study was designed to compare effects of two modeling methods in order to explore a standardized modeling method for premenstrual syndrome (PMS) liver-qi invasion syndrome. Based on the model replication methods, timing stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method and continuous stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method were selected to establish PMS liver-qi invasion rat models. Model rats were treated with Baixiangdan capsules and fluoxetine tablets. As a result, firstly, an optimal modeling method would be chosen by means of comparing and analyzing main behavioral indexes of the two modeling methods. It was found that anxiety-like behavior of rats was occurred through timing stimulation modeling method, which was enhanced in the non-acceptance period and was attenuated in the acceptance period in accordance with various behavioral indexes changes. These phenomena were corrected effectively by drug administration of clinical PMS liver-qi invasion syndrome. Compared with the normal group, behavior indexes of model group presented significant differences. Secondly, continuous stimulation modeling method also led to anxiety-like behavior in rats. However, the anxiety-like behavior indexes did not recovered after drug administration of clinical PMS liver-qi invasion syndrome. Among all behavior indexes, only percentage of open arm time changed significantly both in acceptance and non-acceptance period. Compared with acceptance period, though model rats showed lower open arm entry frequency and percentage scores in the non-acceptance period, and a higher score of locomotor activity in open field test, there did not show significant differences of behavior indexes between the two periods. It was concluded that timing stimulation of emotional distress combining with multivariate segmentation method induced PMS liver-qi invasion rat model successfully, which was in close relation to clinical syndrome.

Premenstrual syndrome, liver-qi invasion, animal model, modeling method

10.11842/wst.2016.02.002

R749

A

（責任編輯：朱黎婷 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-09-28

修回日期：2015-12-28

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81573854）：經前煩躁障礙（PMDD）肝氣逆/郁病證大鼠模型鑒定與標準化，負責人：喬明琦；國家自然科學基金委青年基金（81202617）：母鼠孕前肝疏泄失常對雄性子代行為及神經生化的影響，負責人：魏盛。

＊＊ 通訊作者：魏盛，博士，講師，主要研究方向：情志病證動物模型構建平臺技術及情志致病機理。