基于ITS2序列的中藥材桔梗種子DNA條形碼鑒定＊

劉金欣，潘 敏，張改霞，趙春穎，石林春，＊＊

（1. 承德醫學院河北省中藥研究與開發重點實驗室 承德 067000；2. 濟南市婦幼保健院 濟南 250001；3.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193）

基于ITS2序列的中藥材桔梗種子DNA條形碼鑒定＊

劉金欣1，潘 敏2，張改霞3，趙春穎1，石林春1，3＊＊

（1. 承德醫學院河北省中藥研究與開發重點實驗室 承德 067000；2. 濟南市婦幼保健院 濟南 250001；3.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：桔梗為中國常用大宗藥食兼用中藥材，種植面積廣，建立基于DNA條形碼技術的桔梗種子鑒定方法具有重要意義。方法：本研究共收集29份中藥材桔梗基原植物和種子樣品；利用體式顯微鏡、X射線影像工作站觀察種子的形態特征及種子成熟度；優化DNA提取方法；基于中藥材DNA條形碼鑒定系統（http://www.tcmbarcode.cn）和《中國藥典中藥材DNA 條形碼標準序列》對種子物種進行鑒定。結果：不同群體來源或同一群體來源桔梗種子形態特征存在較大差異，識別困難；本實驗可以實現單粒桔梗種子（約1mg）的DNA提取、PCR擴增和序列測定；5份樣品同一群體內種子ITS2序列存在差異；中藥材DNA條形碼鑒定系統和《中國藥典中藥材DNA 條形碼標準序列》可以作為種子物種鑒定的依據。結論：DNA條形碼分子鑒定法可以對中藥材桔梗種子進行鑒定，同時為中藥材種質資源鑒定提供了新方法，對中藥材種子質量標準的建立提供依據。

桔梗 種子 形態特征 DNA條形碼 鑒定

據2015版中國藥典記載，中藥桔梗為桔梗科多年生草本植物桔梗Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.的干燥根[1]。桔梗為中國常用大宗藥材品種之一，性苦、辛，平，歸肺經，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿等功效，主治咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿等癥[2]。近年來，桔梗市場需求量大，野生資源已不能滿足需求。中國自上世紀70年代起開始栽培桔梗，目前已形成山東淄博，安徽亳州、太和，內蒙赤峰3大道地產區，山東省沂源縣三岔鄉GAP種植區生產的栽培桔梗已占據商品桔梗市場的主導地位[3]。桔梗是一種藥食兩用的中藥材，已列入衛計委藥食同源食品目錄，為朝鮮族的傳統食物，在中國東北地區和韓國大量使用，其主要活性成分是皂苷，該類成分屬五環三萜衍生物，具有抗炎、祛痰、鎮咳、抗潰腸及抗腫瘤、降血壓、擴張血管、解熱鎮痛、鎮靜、保肝、降血糖、抗膽堿、促進膽酸分泌、抗氧化與美容、抗過敏及增強人體免疫力等多種藥理活性[4-7]。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA 序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術，是傳統形態鑒別方法的有效補充，已廣泛用于中藥材（包括藥材及部分藥材飲片）及基原物種的鑒定，特別是名貴珍稀瀕危中藥的鑒定，如冬蟲夏草、石斛等[8-11]。陳士林等建立的全球中藥材DNA條形碼數據庫，已涵蓋中國、日本、韓國、印度、歐盟、美國等6國藥典的幾乎所有草藥品種，將中草藥鑒定從形態鑒定發展到DNA鑒定水平，被稱為中草藥鑒定的文藝復興[12]。辛天怡等將DNA 條形碼技術與二維碼（QR Code）技術相結合，建立中藥材二維DNA條形碼流通監管體系，實現對中藥材流通的數字化監管[13]。此外，應用DNA條形碼技術對“超級食品”枸杞子和紅景天飲片的鑒定，將DNA條形碼分子鑒定法擴展到藥食同源中藥材和中藥材飲片的鑒定領域[14，15]。本研究嘗試將DNA條形碼分子鑒定法用于桔梗種子的真偽鑒定，以保障桔梗種植的種源可靠性，并進一步嘗試擴展DNA條形碼分子鑒定法的適用范圍。

1 材料方法

1.1 材料

本研究共收集29份樣品，包括中藥材桔梗基原植物樣品10份，中藥材桔梗種子樣品19份。桔梗基原植物樣品經中國醫學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，存放在中國醫學科學院藥用植物研究所。種子植物樣品采集于桔梗中藥材產地，樣品存放于國家藥用植物種質資源庫，樣品信息見表1。

表1 實驗樣品信息表

1.2 方法

1.2.1 種子形態特征觀察

選擇飽滿成熟的桔梗種子，使用LY-WNHPCCD型動態顯微成像系統（成都勵揚精密機電有限公司）觀察桔梗種子外部形態特征（如形狀、顏色、表面紋理等）。使用游標卡尺（上海九量五金工具有限公司）測量桔梗種子長、寬、厚。使用Carestream X射線影像工作站系統（加拿大Carestream Health公司）對桔梗種子內部結構進行觀察。采用百粒法測定桔梗種子千粒重[16]。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增及序列測定

取1粒種子，使用75%乙醇擦拭表面，待乙醇揮干后置2.0 mL離心管中，用DNA提取研磨儀（RETSCH MM400，德國）研磨2 min（30次/s），使用天根植物DNA提取試劑盒提取總DNA，加入裂解液后，使用DNA提取研磨儀重復研磨1次，65℃水浴2 h，剩余步驟參照《中國藥典中藥材DNA 條形碼標準序列》[8]。用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美國）檢測DNA質量。PCR擴增引物、體系及反應條件參照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[9]。

1.2.3 數據分析

測序峰圖利用CodonCode Aligner V5.1.5（Codon-Code Co.，美國）進行拼接和校對。依照中藥材DNA條形碼指導原則進行測序峰圖質量評估。基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov model）注釋獲得ITS2序列[17]。使用MEGA 6.0進行序列比對、變異分析和遺傳距離計算[18]。基于中藥材DNA條形碼鑒定系統（http://www.tcmbarcode.cn）和《中國藥典中藥材DNA 條形碼標準序列》進行物種鑒定[8, 9]。

2 結果

2.1 桔梗種子形態特征

桔梗種子以倒卵狀橢圓形為主，成熟種子棕色或深褐色，成熟度較差的種子顏色稍淺，桔梗種子群體顏色不均勻。桔梗種子平均長度2.21 cm，平均寬度1.34 cm，平均厚度0.67 cm，千粒平均質量1.19 g，桔梗種子群體大小較不均勻。桔梗種子在自然光下有光澤，一側珠被表皮細胞外凸形成種翅，常較窄，顏色稍淺或呈淡棕黃色。桔梗種子在40倍體式顯微鏡下可觀察到較密的黑色細紋。X光透視觀察桔梗種子胚乳白色半透明，胚極小，呈一亮點，成熟度較差的種子顏色暗淡，胚乳不飽滿或觀察不到胚，桔梗種子群體成熟度差異較大。

2.2 桔梗種子DNA提取優化、PCR擴增和測序

桔梗種子較小，單粒種子質量僅約1 mg，DNA提取需挑選成熟度較好的飽滿種子。桔梗種子胚乳具油性，含有較多的糖類、脂類和蛋白質，消化后需加入與裂解液等體積的氯仿∶異戊醇混合液（體積比24∶1）進行抽提，并加入等體積預冷異丙醇沉淀DNA，沉淀中常見部分白色膠狀物質。由于桔梗種子較小，過柱純化后加入30-50 μL無菌水洗脫獲得DNA。NanoDrop 2000檢測DNA純度常較差，260/230常小于1，但不影響后續PCR擴增和測序。所有樣品都可成功進行PCR擴增并獲得高質量雙向測序結果。

2.3 桔梗種子物種DNA鑒定和純度檢測

本研究共獲得67條序列，其中基原植物序列10條，種子序列57條，分為4個不同的單倍型，主導單倍型與《中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列》中桔梗主導單倍型序列特征相同。20位點未發現插入/缺失變異。59位點新發現T-C變異，為來自于河南和安徽的2份種子樣品。將所獲得的桔梗4個單倍型ITS2序列，依次輸入中藥材DNA條形碼鑒定系統（http://www.tcmbarcode.cn）的植物類藥材鑒定（ITS2）窗口，點擊提交進行鑒定。鑒定結果顯示，所有4個單倍型均與桔梗科植物桔梗P. grandiflorum的序列最為接近。此外，14份樣品內ITS2序列無差異，5份樣品內ITS2序列存在差異。

圖1 種子群體圖、40倍顯微圖和X光透視圖

3 討論

3.1 市售桔梗種子形態特征差異較大，識別困難

桔梗為桔梗科多年生草本植物，據《中國植物志》英文修訂版記載，中國桔梗屬僅桔梗1個物種，花色藍色或紫色，少有粉色和白色。桔梗是一種藥、食、賞兼用植物，在中國、前蘇聯遠東地區、朝鮮半島、日本列島均有分布，為廣布種，種質資源豐富，不同種源甚至同一種源群體內的種子形狀、顏色、種翅的寬窄、顏色等性狀存在明顯差異，單純依賴形態特征進行鑒定較困難[19]。本研究結果表明，19份桔梗種子樣品中，5份樣品存在群體內ITS2序列差異。自然條件下桔梗主要依靠異花授粉，自花授粉結實率低，不同種源雜交后收獲的F0種子中，存在不同于黑色或棕色的黃綠色、灰綠色桔梗種子或雜色種子及各種過渡類型的種皮顏色[20]。桔梗花期較長，市售桔梗種子的成熟度存在較大差異[21]。X光透視發現多數種子樣品存在不同比例種子的顏色暗淡，胚乳不飽滿或觀察不到胚。不同成熟度的桔梗種子不僅形態特征存在差異，而且影響種子的發芽率。

3.2 種子鑒定尚缺乏統一方法，DNA條形碼技術具有明顯優勢

中藥材質量控制需要中藥材生產的規范化，中藥材生產規范化需要中藥材種子生產的標準化[22]。種子是中藥材生產的物質基礎，優良品種及優質的種子是實現中藥材規范化生產的基礎。當前中藥材種子處于管理真空，尚無專門針對中藥材種子質量檢驗、控制的機構和執法部門，在從法理職能上隸屬于農業系統，多數中藥材種子缺乏國家質量標準[23]。絕大部分種子主要來自藥材生產基地和農戶留種，種子經營無專業市場與渠道，種子質量參差不齊，種源混雜，存在摻偽現象[24]。中藥材種子以形態鑒定為主，如種子形狀、大小、顏色、光澤、表面紋理、表面附屬物、內部解剖結構（胚的性狀、大小、位置、胚乳）等[25]。某些特征常受種質資源、群體差異、種子成熟度、自然天氣等影響，并不穩定[19]。DNA條形碼技術擺脫了傳統形態鑒定方法依賴長期經驗的障礙，鑒定客觀，其指導原則已經納入中國藥典[26]。本研究優化種子DNA提取方法，可以獲得桔梗單粒種子的DNA條形碼序列，然后依照《中國藥典中藥材DNA 條形碼標準序列》和中藥材DNA條形碼鑒定系統對桔梗種子進行鑒定，為其他中藥材種子鑒定提供參考。

表2 基于中藥材DNA條形碼鑒定系統的桔梗種子單倍型鑒定結果

1 國家藥典委員會.中國藥典(一部).北京:中國醫藥科技出版社, 2015∶ 277.

2 徐國鈞,徐珞珊.常用中藥材品種整理和質量研究,南方協作組(第二冊).福建:福建科學技術出版社, 1997∶ 218-238.

3 胡世林.中國道地藥材. 哈爾濱:黑龍江科學技術出版社, 1989∶38.

4 何美蓮,程小衛,陳家寬,等.桔梗皂苷類成分及其質量分析.中藥新藥與臨床藥理, 2006, 16(6)∶ 457-460.

5 宋楊,齊云.桔梗的藥理研究進展.中國藥房, 2006, 17(2)∶ 140-141.

6 泰陽,侯建平,孟建國,等.桔梗的藥理學研究進展.現代中醫藥, 2009(6)∶ 74-75.

7 金在久.桔梗的化學成分及藥理和臨床研究進展.時珍國醫國藥, 2007, 18(2)∶ 506-509.

8 陳士林.中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列.北京:科學出版社, 2015∶ 367-368.

9 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材 DNA條形碼分子鑒定指導原則.中國中藥雜志, 2013, 38(2)∶ 141-148.

10 Xiang L, Song J, Xin T, et al. DNA barcoding the commercial Chinese caterpillar fungus. FEMS Microbiol Lett, 2013, 347(2)∶ 156-162.

11 Yao H, Song J Y, Ma X Y, et al. Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA-trnH intergenic region. Planta Med, 2009, 75(6)∶ 667-669.

12 Chen S, Pang X, Song J, et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnol Adv, 2014, 32(7)∶1237-1244.

13 辛天怡,李西文,姚輝,等.中藥材二維 DNA 條形碼流通監管體系研究.中國科學:生命科學, 2015, 45(7)∶ 695-702.

14 Xin T, Yao H, Gao H, et al. Super food Lyciumbarbarum (Solanaceae) trace ability via an internal transcribed spacer 2 barcode. Food Res Int, 2013, 54(2)∶ 1699-1704.

15 Xin T, Li X, Yao H, et al. Survey of commercial Rhodiola products revealed species diversity and potential safety issues. Sci Rep, 2015, 5∶8337.

16 肖承鴻,周濤,江維克,等.太子參種子品質檢驗方法及質量分級標準研究.中國中藥雜志, 2014, 39(16)∶ 3042-3047.

17 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28SrRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430(1-2)∶ 50–57.

18 Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol Biol Evol, 2013, 30(12)∶ 2725-2729.

19 孫麗娜,嚴一字,李美善,等.桔梗種群內種子形態的變異類型研究.延邊大學農學學報, 2007, 29(1)∶ 19-23.

20 魏建和,楊世林,李先恩,等.桔梗不同種質的比較研究——桔梗的雜交有花色,種色的新類型與分離.中草藥, 2002, 33(5)∶ 455-458.

21 劉自剛,張雁,王新軍,等.桔梗種子活力研究進展.種子, 2006, 25(4)∶ 48-51.

22 魏建和,楊成民,隋春,等.中藥材新品種選育研究現狀,特點及策略探討.中國現代中藥, 2011, 13(9)∶ 3-8.

23 魏建和,陳士林,程惠珍,等.中藥材種子種苗標準化工程.世界科學技術-中醫藥現代化, 2006, 7(6)∶ 104-108.

24 張麗萍,王康正.我國藥材種子種苗產業存在的問題及其對策.中國中藥雜志, 1999, 24(10)∶ 579-581.

25 郭巧生.中國藥用植物種子原色圖鑒.北京:中國農業出版社, 2009∶ 364.

26 國家藥典委員會.中國藥典(2010年版第三增補本).北京:中國醫藥科技出版社, 2014∶ 217.

Identification of Platycodonis Radix Seeds by Using ITS2 DNA Barcode

Liu Jinxin1, Pan Min2, Zhang Gaixia3, Zhao Chunying1, Shi Linchun1, 3(1. Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Chinese Medicine, Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 2. Jinan Maternity and Child Care Hospital, Jinan 250001, China; 3. Institute of Chinese Materia Medica, Peking Union Medical College, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100193, China )

Platycodonis radix is one of the common used herbs, and is widely applied for both medicines and food. To establish a method for identifying the Platycodonis radix by using DNA barcoding is a very important target. In this study, 29 specimens including leaves and seeds of Platycodonis radix had been collected from nine provinces. The morphological characters were surveyed with stereoscopic microscope and X-ray workstation. DNA was extracted from a single seed via optimizing the DNA extraction method. The species identification for each sample was carried out according to DNA barcode identification system (http://www.tcmabarcode.cn) and standard Platycodonis radix barcodes from the book, The Standard DNA Barcodes of Chinese Material Medica in Chinese Pharmacopoeia. The results showed that the morphological characters and grades of maturity remain presented some differences among specimens from different sources. This experiment can realize the DNA extraction, PCR amplification and sequence determination of a single Platycodonis radix seed (about 1 mg). ITS2 sequences from five seed specimens lacked consistence. The Chinese material medica DNA barcode identification system and The Standard DNA Barcodes of Chinese Material Medica in Chinese Pharmacopoeia can be used as references for the seed identification. It was concluded that the seed of traditional Chinese materials can be identified through DNA barcoding method, which will contribute to the seed and seedling standardization project of medicinal materials.

Platycodonis radix, seed, morphological character, DNA barcoding, identification

10.11842/wst.2016.02.005

R282.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-01

＊ 國家自然科學基金委青年科學基金項目（81303158）：全基因組關聯分析鑒定深層發酵靈芝菌株三萜高產關聯多態性位點，負責人：石林春；科學技術部國家科技支撐計劃（2011BAI07B08）：中藥材質量評價體系建立及其質量標準示范研究子課題——中藥種子種苗 DNA條形碼鑒定及流通管理平臺的建立，負責人：陳士林。

＊＊ 通訊作者：石林春，副研究員，主要研究方向：中藥資源與鑒定研究。