瀕危藥用植物新疆阿魏cDNA文庫構建與微衛星標記＊

王果平，樊叢照，羅紅梅，季愛加，宋 駿，李曉瑾＊＊

（1.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所 烏魯木齊 830002；2.中國醫學科學院 中國協和醫科大學 藥用植物研究所 北京 100193)

瀕危藥用植物新疆阿魏cDNA文庫構建與微衛星標記＊

王果平1，樊叢照1，羅紅梅2，季愛加2，宋 駿1，李曉瑾1＊＊

（1.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所 烏魯木齊 830002；2.中國醫學科學院 中國協和醫科大學 藥用植物研究所 北京 100193)

目的：測試和分析新疆阿魏轉錄組，挖掘基因表達譜多態性標記（EST-SSRs），為新疆阿魏屬植物遺傳多樣性、生物學特性、功能基因鑒定和瀕危機制的研究奠定基礎。方法：提取新疆阿魏莖葉總RNA，反轉錄合成cDNA，應用454 GS FLX Titanium進行測序，并對其序列進行拼接，獲得一致性序列（Unique Sequences）；使用Simple Sequence Repeat Identification Tool（Perl Script）對一致性序列進行分析，檢索SSRs模體，采用Primer 5及SSR Hunter軟件設計引物并進行PCR擴增。結果：高通量測序獲得新疆阿魏ESTs序列550 200條，經拼接得到60 248條Unique Sequences，從中發現1 916個EST-SSRs，平均每100 kb出現3.18個SSR，其中二核苷酸最多，GA重復最常見，隨機挑選5條序列擴增及測序結果表明，80%的SSR位點與Sanger測序結果一致。結論：通過轉錄組測序首次獲得新疆阿魏EST-SSRs，為新疆阿魏生物學特性及瀕危機制研究奠定了基礎。

新疆阿魏 EST-SSRs 高通量測序 分子標記

藥材阿魏為傘形科阿魏屬植物花莖中具有特殊氣味的油膠樹脂，歐亞多國皆有阿魏的藥用歷史。在中國，阿魏最早收載于《唐本草》（公元659年），其后歷代本草均有記載，具有解痙、祛風、止瀉、除腸蟲、治療哮喘、癲癇及抗流感等功效[1-12]。《中華人民共和國藥典》收載新疆阿魏Ferula sinkiangensis為阿魏藥材基原植物之一，僅分布于中國新疆伊犁地區。因其為多年生一次結果早春草本植物，阿魏藥材產自其花莖，過度采收將嚴重影響植物的繁衍，加之當地過度墾荒及氣候變化等原因，阿魏的野生植物資源極度萎縮，現已被列為國家三級瀕危保護植物[13]。因此，探索研究其瀕危機制對新疆阿魏的資源保護及可持續利用具有重要的現實意義。

微衛星序列（Simple Sequence Repeat，SSR）標記是近年來發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術。SSR是一類由幾個核苷酸（一般為1-6個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列，存在于真核生物的基因組中，因其數量豐富、多態性高、共顯性等特點常被作為遺傳標記廣泛應用于動植物的遺傳和育種研究實踐中[14]。EST-SSRs是基于表達序列標簽建立的分子標記，它在遺傳作圖、資源多樣性、功能基因的發現與定位、物種起源與進化和比較基因組學研究等方面有著重要的利用價值。近年來EST-SSRs作為分子標記在農作物大麥、甜瓜及馬鈴薯等領域有著廣泛的應用，亦有用于紅豆杉、金銀花等藥用植物[15-19]。本研究擬采用高通量測序技術測試其轉錄組，挖掘基因表達譜多態性標記（EST-SSRs），為新疆阿魏屬植物遺傳多樣性、生物學特性、功能基因鑒定和瀕危機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

新疆阿魏F. sinkiangensis植物樣本采自新疆伊寧縣拜石墩新疆中藥民族藥研究所新疆阿魏野生撫育基地，隨機選取植株幼嫩莖葉，采集后即刻用清水清洗5-8次，吸水紙吸干葉表面水分，迅速保存于液氮中備用。

1.2 RNA 提取與cDNA合成

隨機選取3份樣本，合并后采用總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司，批號：RP 2801）提取新疆阿魏莖葉總RNA，Oligotex?mRNA kit（德國Qiagen公司，批號：70022）分離純化mRNA。以2 μg mRNA為模板，利用SMARTTMPCR cDNA Synthesis kit（美國Clontech公司，批號：634902）反轉錄合成cDNA。采用PCR Advantage II polymerase（美國Clontech公司，批號：639201）對cDNA 進行擴增，擴增條件為95℃，1 min；94℃，15 s；65℃，30 s；68℃，6 min，13個循環。采用PureLink TM PCR Purification kit（美國Invitrogen公司，批號：K310001）去除體系中小于300 bp的片段。

1.3 454文庫構建和測序[21，22]

將5 μg雙鏈cDNA 打斷為300-800 bp的片段，兩端添加特異性銜接子A和B，變性為單鏈連接到磁珠上，經emPCR富集，置于PicoTiter Plate板，應用高通量測序平臺454 GS FLX Titanium測序。

表1 阿魏轉錄組測序與組裝結果

1.4 序列拼接

采用GS-FLX Software去除銜接子區域和低質量序列，屏蔽SMART PCR 引物。將測序序列利用GS De Novo Assembler軟件進行拼接，所有分析使用默認參數。

1.5 微衛星標記檢索

采用Simple Sequence Repeat Identification Tool檢索SSR位點，設置參數如下：序列長度最短為14 bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重復次數分別為7、5、4、3、3次。

1.6 SSR位點驗證1.6.1 引物設計

隨機選取5條含有SSR位點的Unique Sequences，采用SSRHunter軟件對序列進行分析，采用Primer5軟件在SSRs側翼序列設計PCR引物，引物設計參數采用默認設置。

1.6.2 PCR擴增體系及反應條件

SSRs引物擴增體系為25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR Mastermix（天根生化科技有限公司，批號：KT201），基因組DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，H2O 8.5 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性1 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸5 min。

1.6.3 擴增結果檢測

PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由美吉生物測序公司雙向測序，測序峰圖利用CodonCode Aligner V 4.0.4（美國CodonCode公司）校對拼接，去除引物區，并采用SSRHunter軟件檢驗SSR位點。

2 結果與分析

2.1 測序和序列拼接

以新疆阿魏莖葉為材料，總RNA的提取結果較好，條帶清晰。構建的新疆阿魏cDNA文庫中，1/2測序反應獲得數據總量為167.39 Mb，EST序列550 200條，所有ESTs通過GS FLX ASSEMBLER軟件拼接，去除200 bp以下的序列，獲得60 248 條Unique Sequences，包括10 446個序列重疊群（isotig）和49 802條單一序列（singleton），堿基總數為26 578 204 bp，最長序列為3 744 bp，最短200 bp，平均長度為441.26 bp。

2.2 新疆阿魏EST-SSRs的特征

在新疆阿魏莖葉60 248個unigene中搜索到1 916個SSR 位點，占unigene序列的3.18%, 平均每100 kb出現3.18個SSR。SSR種類豐富，二至六核苷酸重復類型均存在，重復次數也存有差異（表2）。在不同核苷酸重復類型中，最常見的是二核苷酸，占總ESR-SSRs的31.99%，其次是三核苷酸和六核苷酸（22.7%），出現頻率最低的為五核苷酸（6.41%）。

在檢出SSR中，共發現445種基序（motif）類型（圖1），出現頻率最高的10類基序為：GA（135個，7.17%）、AG（108個，5.73%）、TC（103個，5.46%）、TACG（92個，4.88%）、CT/TA（61個，3.24%）、ACGT（54個，2.87%）、GTAC（48個2.55%）、AC（42個，2.23%）、AT（38個，2.02%）、TG（35個，1.86%）。10類基序占所有SSRs出現頻率的38.01%，其中六核苷酸基序類型有291種，其總量最豐富，占總類型的58.75%。

2.3 微衛星標記的驗證

采用SSRHunter及Primer5軟件，在SSRs序列附近設計引物，其中有1 028條EST-SSRs可成功設計正反向引物，包括625條singletons和403條contigs。為了驗證EST-SSRs位點的真實性和可靠性，本實驗隨機選取5條引物進行PCR擴增，5條引物均獲得了測序結果，其中編號為isotig00998、isotig03124、isotig09447、isotig04206的 4條 序列測序結果中SSR位點與contigs中一致，編號為isotig06720的序列Sanger測序結果重復序列為（TG）5，而在454測序中的重復序列為（AT）10。其余4條序列Sanger測序結果中的重復序列與SSRs基序序列一致。

3 討論

近年轉錄組測序等高通量測序技術在眾多植物中得到廣泛應用，EST-SSR亦隨之得到開發與利用。454 GS FLX Titanium高通量測序技術是一種基于焦磷酸測序原理而建立起來的第二代系統，其測序效率遠高于傳統的sanger測序法，但對cDNA文庫的質量有較高的要求，本研究應用了SMART技術制備GS FLX cDNA文庫的方法流程[20，21]，構建了新疆阿魏cDNA文庫，為新疆阿魏物遺傳多樣性、生物學特性、功能基因鑒定和瀕危機制的研究提供新的切入點。

表2 新疆阿魏Unique Sequences的SSR位點預測

圖1 基于模體類型的新疆阿魏EST-SSRs頻率分布

新疆阿魏的ESTs中，四核苷酸為分布最少的模體，可能與四核苷酸SSRs主要位于非編碼區有關，而雙子葉中最具有代表性的重復序列AG在新疆阿魏中占比例較大[22]。在植物中，一般二核苷酸和三核苷酸為最豐富表達模體類型[23]，但在新疆阿魏中最豐富表達模體類型為六核苷酸，與東北紅豆杉研究結果一致[18]。SSR位點中存在較高的六核苷酸比例，即使六核苷酸位點發生變異，但由于突變壓力和某些特定氨基酸的延伸，六核苷酸在基因編碼的移碼突變區存在很強的陽性選擇，使遺傳性狀相對穩定，有利于物種生存[24]。新疆阿魏是否也與東北紅豆杉一樣是古老的物種，還有待于進一步深入研究。基于轉錄組測序的EST-SSRs標記對新疆阿魏及同屬植物的生物學特性、遺傳多樣性、種質資源評價及良種培育等方面具有重要的應用價值。

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cDNA Library Construction and Microsatellite Marker Analysis of the Endangered Medicinal Plant Ferula sinkiangensis

Wang Guoping1，Fan Congzhao1，Luo Hongmei2，Ji Aijia2，Song Jun1，Li Xiaojin
（1.Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnical Materia, Urumqi 830002, China; 2.Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China）

This study aimed to detect and analyze of the transcriptome data of F. sinkiangensis, as well as identify its genetic polymorphism of simple sequence repeats (SSRs) of expressed sequence tags (EST-SSRs), which laid foundations for studies on genus genetic diversity, biological characteristics, identification of functional gene and the endangered mechanism of F. sinkiangensis. Total RNA from the leaves of F. sinkiangensiswas extracted and reversed to cDNA, in order to construct the 454-EST library. Then 454-EST library was sequenced using 454 GS FLX Titanium. After sequences assembly, the unique sequences of F. sinkiangensis were obtained. The SSR identification tool that named Sequence Repeat Identification Tool Simple (Script Perl) was applied to analyze the SSR motif from the obtained unique sequences. Primers were designed by Primer 5 and SSR Hunter software and amplified by PCR. As a result, 550 200 EST sequences of F. sinkiangensis were obtained by high-throughput sequencing, which were assembled into 60 248 unique sequences. Among these unique sequences, 1 916 EST-SSRs sites were discovered with the average of 3.18 EST-SSRs sites in every 100 kb sequences. Among the EST-SSRs sites, dinucleotide SSRs was the richest with G and A nucleotide repeats mostly. In conclusion, EST-SSRs data of F. sinkiangensis was established firstly in this study, which provided the basis for further researches for biological characteristics and endangered mechanisms of F. sinkiangensis through transcriptome sequencing.

Ferula sinkiangensis, EST-SSRs, high-throughput sequencing, molecular marker

10.11842/wst.2016.02.011

R282.2

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 新疆維吾爾自治區科技廳優秀青年科技創新人才培養項目（2013721042）：基于高通量測序技術的瀕危藥用植物新疆阿魏開花調控基因的挖掘，負責人：王果平。

＊＊ 通訊作者：李曉瑾，研究員，主要研究方向：中藥資源。