新疆4種絹蒿屬植物及近緣種銀蒿的ITS/ITS2條形碼鑒定研究＊

劉戈宇，寧慧霞，阿吉艾克拜爾·艾薩

（中國科學院新疆理化技術研究所 省部共建國家重點實驗室培育基地 中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室/新疆維吾爾自治區植物資源化學重點實驗室/新疆特有藥用資源利用重點實驗室 烏魯木齊 830011）

新疆4種絹蒿屬植物及近緣種銀蒿的ITS/ITS2條形碼鑒定研究＊

劉戈宇，寧慧霞，阿吉艾克拜爾·艾薩＊＊

（中國科學院新疆理化技術研究所 省部共建國家重點實驗室培育基地 中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室/新疆維吾爾自治區植物資源化學重點實驗室/新疆特有藥用資源利用重點實驗室 烏魯木齊 830011）

目的：評價ITS/ITS2熱點條形碼序列對新疆4種絹蒿屬植物及其近緣種銀蒿的鑒別能力，為絹蒿屬植物分類鑒定提供分子參考依據。方法：對15份絹蒿屬及銀蒿植物樣本進行DNA提取、PCR擴增、雙向測序，采用 CodonCode Aligner 軟件對序列峰圖進行校對拼接，MEGA6.0分析序列堿基組成及變異，計算K2P遺傳距離并構建聚類鄰接樹，預測ITS2序列二級結構，評估鑒別能力。結果：西北絹蒿、針裂葉絹蒿種內變異位點及信息位點數均小于銀蒿。ITS序列種間、種內遺傳變異均大于ITS2序列。ITS/ITS2序列鄰接（NJ）樹均聚為3支，絹蒿屬、銀蒿1、銀蒿2。絹蒿屬ITS2序列二級結構與銀蒿有 差異。結論：通過ITS/ITS2序列的種間K2P 遺傳距離、鄰接樹、ITS2序列二級結構分析，ITS、ITS2序列具很好的屬鑒定效果，不同產地的針裂葉絹蒿被區分開。

絹蒿 DNA條形碼 ITS ITS2 PCR擴增 遺傳距離

絹 蒿 屬 Seriphidium（Bess）隸 屬 于 菊 科Asteraceae向日葵超族Trib. Heliantheae Cass.春黃菊族Trib. Anthemideae Cass，全世界約有130余種，主要分布于北溫帶的亞歐大陸、北美和北非等地區，中國有31種及3變種[1]。中國絹蒿屬植物分為3類，即三裂葉絹蒿組Sect. Juncea、絹蒿組Sect. Seriphidium、民勤絹蒿組Sect. Minchünensa，其中新疆有26種及2變種[2]。絹蒿根系發達，具有抗旱、抗寒、抗鹽堿適應性強等特性，多生長在草原、半荒漠或荒漠草原地區。部分種類是西北干旱草原的建群種和優勢種，具耐牧、壽命長、產量高及冬春秋季適口性好等特點，是用于防風固沙、水土流失和控制荒漠化的優良牧草，對畜牧業發展和生態建設具有重要意義。部分種因含有α-苧酮、樟腦、α-山道年和β-山道年為主要成分的揮發油，是驅蛔蟲藥的原料，具有重要的藥用開發潛力。銀蒿Artemisia austriaca，俗稱銀葉蒿，隸屬于菊科向日葵超族春黃菊族蒿屬Artemisia矮叢蒿系Caespitosae。銀篙合劑具有解熱鎮痛、抗菌消炎等功效，用于治療感冒身熱、鼻塞、頭痛、咳嗽、咽喉炎和上呼吸道感染。銀蒿含7種微量元素，其中Ca的含量最高，Zn、Na、Fe的含量次之。銀蒿含揮發油，可作香料用；含牲蓄食用的粗蛋白、纖維素，可作牲蓄的飼料，駱駝、羊喜食，馬、驢稍食。銀葉蒿是極好的鑲邊及地被植物，可用在花壇或花鏡中。

絹蒿屬和蒿屬是菊科兩大屬，種類繁多、種類性狀連續性和交叉性極強、地理分布廣泛、演化關系復雜，諸多專業學者對其系統分類學[3,4]、解剖學[5-7]、孢粉學[8,9]、染色體[10]、果實形態特征[11,12]、種子萌發特性[13-15]、生理生態適應性[16,17]等方面研究，試圖將絹蒿屬、蒿屬物種準確分類、鑒定，但其屬下等級的鑒定劃分有較多爭議。林有潤等[3]把系統分類與地史、地質變遷及花粉形態等研究材料結合起來論述蒿屬與鄰近屬的譜系分支，闡明絹蒿屬和蒿屬在系統演化上屬于姐妹屬，二者具有很近的親緣關系，目前中國植物志、新疆植物志和中國高等植物等主要工具書均采用林有潤對蒿屬、絹蒿屬建立的分類體系。

DNA條形碼（DNA Barcoding）利用基因組中一段公認的標準短序列來進行物種鑒定的分子鑒定新技術，由加拿大分類學家Paul Hebert于2003首次提出[18]。該方法通過篩選通用條形碼，建立條形碼數據庫和鑒定平臺，運用生物信息學方法分析比對DNA數據，進而對物種進行鑒定，是傳統生物鑒定方法的有效補充和重大突破，目前已成為物種鑒定和分類研究的熱點[19,20]。該技術被稱為“草藥鑒定從形態到DNA條形碼的文藝復興”（Biotechnology Advances），標志著“中藥鑒定學邁入通用和標準化基因鑒定時代”[21]。DNA條形碼技術已經在中藥材基原鑒定、藥材流通體系等方面得到廣泛推廣和應用[22-28]。

核基因ITS（Internal Transcribed Spacers，ITS）序列具有較快的突變速率，能夠提供豐富的遺傳信息，被認為是陸地被子植物的核心條形碼[29]。而Chen等[30-35]提出在藥用植物及中藥材鑒定中以核糖體DNA ITS2（internal transcribed spacer 2）序列為主、葉綠體psbA-trnH基因間隔區序列（plastid psbA-trnH intergenic region）為輔的鑒定系統。植物核糖體DNA中的內轉錄間隔區ITS2和葉綠體基因psbA-trnH片段在種間及種下居群間具有進化速率快，變異程度高、區分物種能力強的特點，適用于藥用植物與其近緣種類等較低分類階元的分子鑒定[36]。特別是ITS2序列在有毒中藥土荊皮[37]、中藥材地黃[38]、川貝母[39]、山豆根[40]等混偽品基原鑒定中表現了很好的鑒定優勢。

中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則已列入《中華人民共和國藥典》（2010年版第三增補版），陳士林等[41]出版了《中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列》，但其中缺乏關于絹蒿屬、蒿屬等的DNA條形碼信息。有文獻報道蒿屬材料的DNA條形碼研究，用葉綠體psbA-trnH條形碼信息位點可區分形態上非常相似的黃花蒿、茵陳蒿、青蒿[42]。采用藥用植物的4條候選DNA 條形碼序列（ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH）對黃花蒿、艾蒿、茵陳蒿、細裂葉蓮蒿、歧莖蒿、白花蒿、野艾蒿、白蓮蒿、大籽蒿9種常見的蒿屬藥用植物進行鑒定，ITS2序列對9種蒿屬藥用植物的物種水平鑒定成功率最高，成功率為100%[43]。

銀蒿和絹蒿屬雖屬同一科兩個不同的屬，但外部形態極為相似，不易識別，易被混淆，因此找到快速準確的方法鑒別是非常必要的。為評價DNA條形碼熱點序列對新疆常見絹蒿和銀蒿分子鑒定效果，與形態學物種分類鑒定方法對應，尋找一種簡易的分類鑒定方法，本研究選用在植物鑒定中應用廣泛的ITS/ITS2序列，對新疆常見的4種絹蒿屬植物和外部形態極為相似蒿屬植物銀蒿為研究材料進行DNA條形碼分析，考查通用DNA條形碼ITS/ ITS2 序列對絹蒿屬和蒿屬的適用性和鑒定能力，以期為新疆常見絹蒿屬植物提供快速有效的鑒定方法，為DNA條形碼技術在絹蒿屬和蒿屬植物的鑒定研究、開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在新疆境內共收集常見絹蒿屬試驗樣品4 種10 份、銀蒿5份，經新疆農業大學周桂玲教授鑒定為西北絹蒿、博樂絹蒿、伊塞克絹蒿、針裂葉絹蒿、銀蒿。數字影像信息及憑證樣本保存于中國科學院新疆理化技術研究所，樣品信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA的提取

稱取經硅膠干燥的葉片樣品100-150 mg，在干凈的研缽中用液氮迅速研磨成粉，取30 mg于滅菌2.0 mL離心管中使用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP305提取總DNA，其余樣品放于1.5 mL離心管保存于-80℃備用。

1.2.2 引物合成和PCR擴增

引物序列、PCR反應條件和擴增程序見參考文獻[33，44]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，ITS通用引物ITS5F：5′-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3′和ITS4R：5′-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3′；ITS2通用引物 ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反 應 在Eppendorf Mastercycler PCR儀（Eppendorf，德國）上進行，反應體積50.0 μL，體系包含PCR 緩沖液5.0 μL （10×，含MgCl2），dNTP 1.0 μL（10 mmol·L-1），引物各1.0 μL（10 μmol·L-1），Taq酶1.0 μL（2.5U，北京天根生化科技有限公司，ET101-02-01），總DNA 2.0 μL（約50 ng）。PCR程序：首先94℃預變性5 min；其次94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環；最后72℃延伸7 min。PCR擴增產物在冰箱中-20℃保存。

表1 樣品信息

1.2.3 電泳檢測和測序

擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，選擇有明顯特異條帶的樣品測序，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。為保證測序的準確性，均采用正反雙向測序。

1.2.4 數據處理

測序所得的峰圖采用 CodonCode Aligner V3.0軟件（美國CodonCode公司）對序列峰圖進行校對拼接，去除引物區和低質量的序列,根據NCBI 數據庫的BLAST 比對中相似度最高物種的序列邊界，截取各序列邊界。ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法，去除兩端5.8 S 和28 S 區段，獲得標準ITS2 間隔區序列[45]。使用軟件MEGA 6.0計算所得序列的堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉換顛換頻率及其比率[46]，計算物種的種內種間Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離。構建鄰接（Neighbor-joining，NJ）系統發育樹評估各物種之間的親緣性，利用 Bootstrap（1 000 次重復）檢驗各分支的支持率。根據Koetschan等[47]建立的ITS2 序列數據庫及其網站（http://its2-old. bioapps.biozentrum. uni-wuerzburg.de/ cgi-bin/ index.pl?annotator）預測ITS2 序列二級結構。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取與ITS/ITS2序列擴增成功率分析

實驗樣品提取基因組DNA，做為母液，取3 μ L 經0.8%瓊脂糖凝膠電泳后條帶清晰單一，無RNA和蛋白污染。取母液DNA適量稀釋1倍，PCR擴增ITS/ITS2 序列后，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，試驗材料明顯獲得均一條帶，PCR產物用于測序分析。

2.2 4種常見絹蒿屬植物及銀蒿ITS/ITS2序列長度、GC含量及種內變異位點分析

變異位點及信息位點數可反映所分析材料的堿基變異程度。經MEGA6.0比對后，本實驗獲得的10條絹蒿屬植物和5條銀蒿ITS序列長度為719-720 bp，GC含量為51%-56%，平均GC含量為54%， 其中西北絹蒿和針裂葉絹蒿種內變異位點及信息位點數均為9/4，而5份銀蒿種內變異位點及信息位點數較大為64/37。

ITS2序列長度為225-226 bp，GC含量為53%-57%，平均GC含量為56%，4份西北絹蒿種內存在2個 變 異 位 點，為163 bp處（PS0014MT02）、199 bp處（PS0014MT03）C-T變 異，圖1A；4份 針裂葉絹蒿樣品種內存在3個變異位點，為165 bp 處 T-A（PS0018MT02）、166 bp處 T-C變 異（PS0018MT02）、199 bp處 T-C（PS0018MT01、PS0018MT02），圖1B；5份銀蒿種內存在16個變異位點，信息位點數為11，圖1C。

以上結果表明：絹蒿屬、銀蒿物種本身存在一定的變異，ITS變異位點及信息位點數大于ITS2，銀蒿的ITS/ITS2變異位點及信息位點數均大于4種絹蒿。

2.3 4種常見絹蒿屬植物及銀蒿ITS/ITS2序列種間、種內遺傳距離分析

判斷DNA條形碼質量標準之一是該序列是否具有可以區分物種的足夠遺傳變異，物種的序列種間變異較大，種內變異足夠小，即物種種間變異大于種內變異。經MEGA6.0比對分析后，4種絹蒿和銀蒿種間變異位點/信息位點ITS序列為85/55、ITS2序列為23/17。

種間、種內遺傳距離6個值的統計分析見表2，銀蒿ITS序列3個種內遺傳距離值大于ITS2序列，銀蒿的ITS和ITS2序列種內3個遺傳距離值均大于絹蒿屬；絹蒿屬除種內最大距離ITS序列等于ITS2序列外，其他5個值ITS序列均大于ITS2序列；絹蒿屬ITS和ITS2序列種間3個值均小于種內3個值。

圖1 西北絹蒿、針裂葉絹蒿、銀蒿ITS2種內變異位點

表2 ITS/ITS2序列種間及種內遺傳距離分析

2.4 4種常見絹蒿屬植物及銀蒿ITS/ITS2 序列鄰接（NJ）樹鑒定分析

NJ聚類樹狀圖是DNA 條形碼序列物種鑒別的方法之一，而物種鑒定是否成功，看同一個物種的不同個體在構建的NJ系統樹上是否形成單系分支，即同一物種的不同個體能否聚類到一起，如形成單系分支則鑒別成功，反之鑒別不成功。利用MEGA6.0構建ITS和ITS2序列鄰接樹（Neighbor-Joining，NJ），見圖2。由圖2（A、B）可知，整個樹從根部分化為3支，西北絹蒿、博樂絹蒿、伊塞克絹蒿、針裂葉絹蒿4個物種10份材料以99%的支持率聚為一大支絹蒿屬；5份銀蒿形成2個并系性；西北絹蒿、博樂絹蒿、伊塞克絹蒿、針裂葉絹蒿存在聚類融合現象。以上結果說明：對于本研究的4種絹蒿屬植物和銀蒿，ITS和ITS2序列具有很好地鑒定屬的效果。

2.5 4種常見絹蒿屬植物及銀蒿ITS2序列二級結構預測

據ITS2序列數據庫及其網站得知，物種ITS2序列二級結構均為一個中心環（主環）和4 個螺旋區（Helix）構成，4 個螺旋區命名為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，而不同的物種其螺旋區的莖環數目、大小、位置以及螺旋發出的角度有差異。在ITS2序列數據庫網站預測4種絹蒿屬植物、銀蒿的ITS2序列二級結構發現有與其相同的、高度相似的[High Quality Model，all helices（percentages 100/100/100/100）]二級結構模型，4種絹蒿屬植物的ITS2二級結構模型均為圖3A，而5份銀蒿存在3種類型的模型，見圖3B、3C、3D。

A模型在螺旋Ⅰ上有莖環，而B模型沒有，僅存在螺旋Ⅰ這一點區別，中心環和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ螺旋區均相同；模型C與D中心環大小不同，螺旋Ⅰ末端莖環小于D模型；在螺旋Ⅰ和Ⅱ之間中心環上模型C無凸出環，而D有凸出環，除此外，C和D模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ螺旋區均相同。

圖2 基于ITS/ITS2序列構建的4種絹蒿屬植物和銀蒿鄰接（NJ）樹

3 討論

新疆地域遼闊，山脈與盆地相間排列，盆地與高山環抱，喻稱“三山夾二盆”，形成明顯的溫帶大陸性氣候，四季溫較差、晝夜溫差大，季節變化明顯，春季氣溫多變，秋天氣溫驟降，氣溫隨緯度增加、海拔上升而降低，天山南北差異甚大，地貌和土壤復雜多樣，為適應復雜多變的環境，由此形成物種遺傳多樣性高或遺傳變異豐富多彩的蒿屬、絹蒿屬植物資源，新疆是絹蒿屬植物分布中心。蒿自然群種類多、分布廣、分化復雜，植物外部形態極其相近，難于分辨，研究者試圖利用DNA條形碼對其進行基原鑒定、分類。王鐵絹等[48]對蒿屬2個亞屬5個組（艾組、艾蒿組、龍蒿組、牡蒿組、蒔蘿蒿組）38個種進行trnL-F序列分析，trnL-F序列在蒿屬植物間有著高度的一致性，一些種的序列完全相同，來自于不同組的一些植物也具有完全相同的序列，除艾組外，其它組并未得到很好的分化、均沒有形成獨立的分支。Gao等[49]基于實驗樣本和GenBank數據分析，提出ITS2 序列可作為菊科鑒定的DNA條形碼序列，ITS2 序列對蒿屬74個物種的91份樣品的鑒定效率為59.3%（BLAST1），這74個物種中主要是艾蒿、黃花蒿、白花蒿、細裂葉蓮蒿等蒿屬材料。而劉美子[43]利用ITS2 序列的種間K2P 遺傳距離及NJ樹將常見的9種蒿屬黃花蒿、艾蒿、茵陳蒿、細裂葉蓮蒿、歧莖蒿、白花蒿、野艾蒿、白蓮蒿、大籽蒿全部區分，以上研究均不包括本研究的4種絹蒿。

圖3 絹蒿和銀蒿 ITS2 序列二級結構模型

在本研究探討熱點序列IT S/ITS2對西北絹蒿、博樂絹蒿、伊塞克絹蒿、針裂葉絹蒿4種絹蒿屬植物與近緣種銀蒿蒿屬的區分效果，發現西北絹蒿、針裂葉絹蒿間有著高度的一致性，共有的ITS序列變異位點及信息位點數9/4，ITS2序列變異位點及信息位點數2/0、3/1；銀蒿ITS/ITS2序列變異位點及信息位點數分別為64/37、16/11，多于絹蒿屬材料；銀蒿種內遺傳距離值ITS序列大于ITS2序列，并且其ITS/ITS2序列值均大于絹蒿屬；絹蒿屬種內、種間遺傳距離，ITS序列均大于ITS2序列，但種間3個值均小于種內3個值。這說明銀蒿材料的DNA序列變異程度大于4種絹蒿屬材料，ITS/ITS2序列對銀蒿的鑒定區分效果都優于絹蒿屬。

NJ樹鑒定時存在交叉現象，因此根據植物習性、花序、營養葉、根系等形態學劃分的西北絹蒿、針裂葉絹蒿沒有得到很好的分辨。主要是缺乏變異位點，因此由于變異位點的缺乏，在所分析的種中，一些種沒有和本組植物聚到一起。銀蒿5份材料NJ樹聚為2個并系，ITS2序列二級結構模型有3個類型，印證了銀蒿種內本身堿基變異大。西北絹蒿、博樂絹蒿、伊塞克絹蒿、針裂葉絹蒿4種絹蒿屬ITS2序列二級結構模型相同，進一步印證了ITS/ ITS2條形碼序列能很好的鑒定到屬，而對絹蒿屬內種的鑒定分類有一定局限性。

由于植物在進化過中容易發生雜交、網狀進化，且同一基因在不同類群的進化速率不同，4種絹蒿與銀蒿物種之間可能存在雜交漸滲，這可能是ITS/ ITS2序列對4種絹蒿和銀蒿物種鑒別率低的可能原因之一。其次，4種絹蒿可能經歷了快速成種，導致種間在短時間內沒有積累足夠的遺傳變異，物種之間難以分辨，ITS/ITS2物種鑒別能區分到屬。第三，地貌、土壤、氣候等微環境導致同一種物不同產地遺傳差異，4份針裂葉絹蒿PS0018MT01和PS0018MT02采集于新源縣前進牧場，PS0018MT03 和PS0018MT04采集于察布查爾縣白石峰，ITS/ ITS2 NJ樹均顯示PS0018MT03和PS0018MT04聚在一起。

由于樣品量有限，對絹蒿屬植物的DNA條形碼鑒定尚需進一步研究。中藥材DNA 條形碼分子鑒定法在中藥材基原物種鑒定、中成藥流通監管、道地藥材鑒別、保健食品和食品質量安全控制等領域發揮重要作用[50]，葉綠體超級條形碼的提出及應用[51]，均給絹蒿屬DNA條形碼研究提供思路和途徑。

致謝：感謝中科院“西部之光”人才培養計劃“西部博士資助項目”（XBBS201213）資助。感謝中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所韓建萍老師及碩士生王麗麗對數據分析的指導、建議。

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Identification of Four Seriphidium Species and its Close Related Species Artemisia Austriaca in Xinjiang by ITS/ITS2 Barcodes

Liu Geyu, Ning Huixia, Haji Akber Aisa

(Key Laboratory of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry in Arid Regions; CAS Xinjiang Key Laboratory of Plant Resources and Natural Products Chemistry; Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences,Urumqi 830011,China;)

This study aimed to evaluate DNA barcoding, ITS/ITS2 sequence technique, in identification of four common Seriphidium species and A. austriaca in Xinjiang, which provided molecular basis for the identificationof plants in Seriphidium. ITS/ITS2 regions from fifteen Seriphidium species and A. austriaca samples were amplified and sequenced, then assembled by the CodonCode Aligner software. Base composition and variations were analyzed by MEGE 6.0 software. In order to evaluate identification efficiency of ITS/ITS2 barcode, K2P distances of ITS/ITS2 regions were calculated and neighbor-joining (NJ) trees were constructed. ITS2 sequences of the secondary structure were predicted in ITS2 database. It was found that intra-specific variable sites and Parsim-Informative sites of S. nitrosum and S. sublessingianum were less than those of A. austriaca. Interand intra-specific variable sites and Parsim-Informative sites of ITS sequences were more than those of ITS2 sequences. The inter- and intra-specific genetic distances (K2P) of ITS sequences was larger than those of ITS2. All the sequences were clustered into three clades, Seriphidium, A. austriaca 1 and A. austriaca 2, in the NJ trees that constructed with ITS/ITS2 sequences. Secondary structure of ITS2 sequences of four Seriphidium species was different from that of A. austriaca. It was concluded that ITS and ITS2 sequences can identify genus level of S. sublessingianum from different origin efficiently by K2P genetic distance, NJ tree and ITS2 secondary structure model.

Seriphidium, DNA barcoding, ITS, ITS2, PCR amplification, genetic distance

10.11842/wst.2016.02.013

R282.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 中科院“西部之光”人才培養計劃西部博士資助項目（XBBS201213）：新疆蒿屬藥用植物DNA條形碼研究，負責人：劉戈宇。

＊＊ 通訊作者：阿吉艾克拜爾·艾薩，研究員，博士生導師，副所長，主要研究方向：天然藥物化學、民族藥學。