桂枝茯苓膠囊及其成分組合物抗子宮收縮作用及其機制＊

孫 蘭，周 軍，宗紹波，丁 崗，王振中，蕭 偉＊＊，寇俊萍

（1. 中國藥科大學江蘇省中藥評價與轉化重點實驗室 南京 210009；2. 江蘇康緣藥業股份有限公司連云港 222001；3. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

桂枝茯苓膠囊及其成分組合物抗子宮收縮作用及其機制＊

孫 蘭1,2,3，周 軍2,3，宗紹波2,3，丁 崗2,3，王振中2,3，蕭 偉2,3＊＊，寇俊萍1＊＊

（1. 中國藥科大學江蘇省中藥評價與轉化重點實驗室 南京 210009；2. 江蘇康緣藥業股份有限公司連云港 222001；3. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

目的：研究桂枝茯苓膠囊及成分組合物（14個成分）對子宮平滑肌收縮抑制作用及其機制。方法：采用 前列腺素F2α（Prostaglandin，PGF2α）誘導的子宮平滑肌收縮模型，檢測PGF2α誘導后的子宮組織p42/44絲裂原激活蛋白激酶（p42/44 MAPK）磷酸化及 間隙連接蛋白43 （Cx43）的表達水平，考察其抑制離體子宮平滑肌收縮可能的作用機制。結果：桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制子宮幅值50%濃度（IC50）分別為130.40、46.67 μg·mL-1；桂枝茯苓膠囊及其組合物能抑制PGF2α誘導的子宮組織p42/44MAPK磷酸化和Cx43水平升高。結論：桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制PGF2α誘導的子宮平滑肌收縮作用，其機制可能與降低子宮組織p42/44MAPK磷酸化水平、抑制Cx43蛋白表達增高有關。

桂枝茯苓膠囊 成分 前列腺素F2α子宮收縮

桂枝茯苓丸源于《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍五味藥材而成，有著2 000余年的臨床用藥歷史，是歷代醫家治療婦科疾病的首選良方。桂枝茯苓膠囊（Guizhi Fuling Capsule，GZFLC）是在桂枝茯苓丸基礎上利用現代工藝研制而成的新藥，具有活血化瘀、消癥之功效，臨床上主要用于治療原發性痛經、子宮肌瘤、慢性盆腔炎包塊、 子宮內膜異位癥等。文獻研究表明桂枝茯苓膠囊用于原發性痛經具有較好療效[1-4]，對其他疾病引起的疼痛也有較好治療作用[5-7]。本文采用PGF2α誘導子宮收縮試驗研究桂枝茯苓膠囊及其成分組合物（GZFLC中主要質控成分）對子宮收縮的抑制作用并探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

ICR小鼠，清潔級，雌性，體質量18-20 g [揚州大學比較醫學中心，合格證號：SCXK（蘇）2012-0004]。動物分籠飼養，每籠5只，溫度維持在20-25℃，相對濕度：40-70%，12 h光照周期，自由攝食和飲水。

1.2 藥物與試劑

桂枝茯苓膠囊，規格：0.31 g/粒（江蘇康緣藥業股份有限公司，批號：130816）；苯甲酸雌二醇注射液，規格：2 mL∶4 mg（寧波第二激素廠，批號：20131116）；生理鹽水，規格：100 mL/瓶（山東齊都藥業股份有限公司，批號：130908）；PGF2α（美國Sigma公司，批號：SLBD9804V）；樂氏液，臨用時自配（NaCl 9.20 g，KCl 0.42 g，CaCl 20.24 g，NaHCO30.15 g，Glucose 1.00 g溶解于1 000 mL雙蒸水中即得，pH=7.4）；磷酸化p42/44絲裂原激活蛋白激 酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）（Thr202/Tyr204）E10單克隆抗體（德國CST公司，貨號：9101）；Cx43單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，貨號：A-1352）；β-Actin Antibody（德國CST公司，貨號：4967）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；沒食子酸、茯苓酸、苦杏仁苷、槲皮素、桂皮醛、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖、香豆素、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、白芍苷、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 儀器

電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；CENTRFNGE 5840R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；PowerLab 16/35生物信號采集系統，PL3508B6/25-220型8腔離體組織灌流系統，Chart 7數據分析軟件（澳大利亞AD Instruments公司）；Milli-Q Plus超純水裝置（美國Millipore 公司）；PHSJ-4FPH 指示計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；垂直電泳槽 （美國Bio-Rad公司）；轉移電泳槽（美國Bio-Rad公司）；全自動數碼成像系統及分析系統（美國SYNGENE公司GeneGenius系統）。

2 方法

2.1 桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制小鼠離體子宮收縮量效關系考察

未孕小鼠頸背部皮下注射苯甲酸雌二醇5 mg·kg-1，增加子宮的敏感性。于注射后24 h脫頸椎處死小鼠，剝取子宮并清洗，用細線分別扎住子宮2端，分別固定于浴槽底部及張力換能器上。置于裝有20 mL樂氏液恒溫浴槽中，溫度為37±0.1℃，通入95%O2+5%CO2，通過調節螺母加1 g的負荷（10 mN），平衡40 min，待子宮收縮穩定，自發節律恢復后，開始進行實驗。預先記錄10 min正常收縮曲線，隨后加入PGF2α（終濃度1 μg·L-1），作用15 min后分別加入桂枝茯苓膠囊（終濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg·mL-1）或成分組合物（終濃度為0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）（溶于含1%DMSO去離子水），以含1%DMSO去離子水為對照組。記錄給藥后子宮收縮幅度，觀察藥物對PGF2α致子宮節律收縮的對抗作用，統計給藥前10 min及給藥后10 min內子宮的收縮幅度，計算抑制率%（IR），IR=（給藥前幅值-給藥后幅值）/給藥前幅值×100%。

2.2 桂枝茯苓膠囊及成分組合物抑制子宮平滑肌收縮的離體研究

向浸泡小鼠子宮平滑肌的浴槽中分別加入以下樣品：除正常對照組外各組均加入PGF2α（終濃度1 μg·L-1），15 min后桂枝茯苓膠囊組再加入終濃度為130.4 μg·mL-1的藥物，成分組合物組再加入終濃度為46.67 μg·mL-1的藥物，正常組及PGF2α加入含1%DMSO去離子水。15 min后各組取小鼠子宮平滑肌組織采用Western blot方法檢測p42/44 MAPK、Cx43蛋白表達情況。主要步驟如下：稱取小鼠平滑肌組織，液氮速凍、研磨粉碎后，加入含有蛋白酶抑制劑的全細胞裂解液，提取總蛋白，BCA法蛋白定量。12%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌3次后，分別加入兔抗鼠p42/44 MAPK（以1∶500稀釋）、Cx43（以1∶800稀釋）和β-actin（以1∶1 000稀釋）一抗。4℃孵育過夜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（以1∶2 000稀釋）孵育2 h。用化學發光法顯影，凝膠成像分析系統拍照。

2.3 結果處理和分析

實驗數據用Graphpad Prism 5.0統計作圖軟件分析，結果采用均數±方差（）表示。組間比較采用two-way ANOVA分析，P=0.05認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 桂枝茯苓膠囊成分組合物抑制小鼠離體子宮收縮量效關系考察

結果顯示，桂枝茯苓膠囊3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg·mL-1及組合物0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1劑量下對子宮平滑肌收縮的抑制作用逐漸增強，并呈現一定的量效關系。桂枝茯苓膠囊的IC50為130.40 μg·mL-1，組合物的IC50為46.67 μg·mL-1。結果見表1、表2。

3.2 桂枝茯苓膠囊成分組合物抑制子宮平滑肌收縮的離體研究

桂枝茯苓膠囊及組合物p42/44MAPK磷酸化和Cx43的蛋白表達水平相比較PGF2α誘導組灰度值均下降，即 桂枝茯苓膠囊及其組合物能抑制PGF2α誘導的p42/44MAPK磷酸化和 Cx43水平升高。結果見圖1、圖2。

表1 桂枝茯苓膠囊對PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

表1 桂枝茯苓膠囊對PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

注：與溶媒組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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表2 成分組合物PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

表2 成分組合物PGF2α致小鼠離體子宮平滑肌收縮抑制作用（，n=8）

注：與溶媒組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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圖1 桂枝茯苓膠囊及其組合物對p42/44 MAPK磷酸化、Cx43蛋白表達水平影響

4 討論

原發性痛經是指月經前及行經期間，下腹及腰部痙攣性疼痛。病理改變主要包括子宮平滑肌和子宮壁螺旋動脈強烈收縮、缺血以及缺氧等。流行病學研究表明原發性痛經是目前婦科最常見疾病[8]。原發性痛經的發病機制，主要與月經期子宮內膜合成和釋放前列腺素增加有關[9，10]，也與精神、及某些生化代謝物質有關[11，12]，臨床上常用非甾體抗炎藥和口服避孕藥治療痛經[13]。

圖2 桂枝茯苓膠囊及其組合物對p42/44 MAPK磷酸化、Cx43蛋白表達

MAPK是一組在真核生物中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內重要的信號傳遞者，參與多種生理過程的調節[14]。研究認為子宮平滑肌組織中表達Cx43[15，16]。Cx43在 細胞膜上形成細胞間隙連接通道分子，使功能相同的細胞產生同步效應，對子宮平滑肌收縮的協調性發揮重要的調控功能[17]。PGF2α致子宮平滑肌收縮與p42/44MAPKCx43信號途徑有關[18]。

本實驗結果表明，桂枝茯苓膠囊及成分組合物系列濃度對子宮收縮具有抑制作用，且具有量效關系，桂枝茯苓膠囊及組合物p42/44MAPK磷酸化和Cx43的蛋白表達水平相比較PGF2α誘導組灰度值均下降，結果提示桂枝茯苓膠囊對離子子宮具有顯著抑制作用，其機制與抑制PGF2α誘導的p42/44MAPK磷酸化和Cx43水平升高有關，桂枝茯苓膠囊對原發性痛經具有治療作用，其中14個化合物可能起主要作用。

1 李萍,曹保利.桂枝茯苓膠 囊治療原發性痛經90例臨床觀察.天津藥學, 2009, 21(1)∶ 34.

2 柳于介,蕭偉,王振中,等.不同劑量桂枝茯苓膠囊治療原發性痛經療效探索研究.中國中藥雜志, 2013, 38(12)∶ 2019-2022.

3 馬玉俠,衣華強,孫玉國,等.痛經 相關測評量表與評估方法研究進展.山東中醫藥大學學報, 2009, 339(4)∶ 347-348.

4 程婷.桂枝茯苓膠 囊治療原發性痛經的臨床觀察.北京:北京中醫藥大學碩士學位論文, 2011∶ 34-36.

5 張國華.觀察桂枝茯苓膠囊治療子宮內膜異位癥療效.遼寧中醫藥大學學報, 2012, 14(4)∶ 188-189.

6 常改芝.桂枝茯苓 膠囊治療子宮內膜異位癥痛經及對血清CA125的影響.中國中醫急癥, 2011, 20(5)∶ 831-832.

7 張海琴,劉瑞芬.活血化瘀法對慢性盆腔炎大鼠免疫調節的實驗研究.世界科學技術-中醫藥現代化, 2013, 15(9)∶ 2042-2046.

8 暢艷艷,鄧瑜.中醫藥治療原發性痛經的研究概況.中醫藥導報, 2010, 16(10)∶ 105-107.

9 曹澤毅.中華婦產科學.北京:人民衛生出版社, 2004∶ 217-221.

10 段金廒,劉培,宿樹蘭,等.基于方劑功效物質組學的四物湯類方用于婦科血瘀證原發性痛經的方-證-病關聯規律分析.世界科學技術-中醫藥現代化, 2013, 15(2)∶ 167-176.

11 樂杰.婦產科學.北京:人民衛生出版社, 2001∶ 380-381.

12 連鳳梅,趙瑞華,姜羨華,等.原發 性痛經的中 醫證候分布特點分析.世界科學技術-中醫藥現代化, 2007, 9(4)∶ 96-100.

13 萬成 雨.中醫治療原發性痛經研究進展.遼寧中醫藥大學學報, 2015, 17(1)∶ 222-224.

14 張美榮,劉舉,王洋.絲裂原激活蛋白激酶相關疾病及其藥物的研究進展.中國藥物化學雜志, 2014, 24(3)∶ 231-240.

15 何淑瓊.縫隙連接蛋白43在子宮平滑肌細胞的表達調控.國際婦產科學雜志, 2010, 37(4)∶ 253-256.

16 顏建英,黃科華,劉青閩,等.產婦子宮平滑肌組織中MAPK 信號轉導通路及CX43表達與產后出血關系的研究.實用婦產科雜志, 2012, 28(7)∶ 565-570.

17 Sakata M, Sado T, Kitanaka T, et al. Iron-dependent oxidative stress as a pathogenesis for preterm birth. Obstet Gynecol Surv, 2008, 63(10)∶651-660.

18 林先明,胡本容,李真,等. P42/44MAPK對PGF2α所致大鼠子宮平 滑肌收縮中Connexin 43表達的介導.華中科技大學學報(醫學版), 2002, 31(4)∶ 370-375.

Inhibition Effects and Mechanism of Guizhi Fuling Capsule and Its Containing Active Ingredients on Uterine Contraction

Sun Lan1,2,3, Zhou Jun2,3, Zong Shaobo2,3, Ding Gang2,3, Wang Zhenzhong2,3, Xiao Wei2,3, Kou Junping1
(1. Jiangsu Key Laboratory of TCM Evaluation and Translational Research, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China; 3. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process New-tech for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China)

The goal of the investigation was to uncover the inhibition effects of Guizhi Fuling Capsule (GZFLC) and its fourteen active ingredients against uterine contraction and the mechanism. PGF2αinduced uterine smooth muscle contraction model was established to observe the inhibition effects of GZFLC and its active ingredients. Expressions of p42/44 mitogen-activated protein kinase (p42/44 MAPK) phosphorylation and gap junction protein connexin 43 (Cx43) were quantified in order to test the inhibition effects against uterine smooth muscle contraction in vitro and elucidate possible mechanisms. The results showed that the concentrations of GZFLC and the containing active ingredients, which induced 50% inhibition (IC50) of uterine contraction amplitude, were 130.40 and 46.67 μg·mL-1, respectively. GZFLC and its active ingredients also suppressed p42/44 MAPK phosphorylation level and Cx43 expression in the uterus tissue in PGF2α-induced model animals. It was concluded that GZFLC and the containing active ingredients inhibited the uterine smooth muscle contraction which induced by PGF2α. And the mechanism may be related to lower p42/44 MAPK phosphorylation and Cx43 protein levels in uterine.

Guizhi Fuling capsule, active ingredients, PGF2α, uterine contraction

10.11842/wst.2016.02.021

R285

A

（責任編輯：朱黎婷 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-02-04

修回日期：2015-11-02

＊ 科學技術部國家“重大新藥創制”科技重大專項“十二五”計劃資助項目（2013ZX09402203）：現代中藥創新集群與數字制藥技術平臺，負責人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，研究員級高級工程師，博士生導師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發；寇俊萍，博士生導師，主要研究方向：中藥及中藥復方物質基礎及作用機制研究。