水鈉潴留在痰濕壅盛證高血壓大鼠模型中的機制研究＊

孟憲卿，楊傳華，吳 賽，姜月華，吳 波

（1.山東中醫藥大學 濟南 250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院 濟南 250011）

水鈉潴留在痰濕壅盛證高血壓大鼠模型中的機制研究＊

孟憲卿1，2，楊傳華2＊＊，吳 賽1，姜月華2，吳 波2

（1.山東中醫藥大學 濟南 250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院 濟南 250011）

目的：由飲食誘導建立高血壓痰濕壅盛證大鼠模型，探討水鈉潴留在痰濕壅盛證高血壓大鼠模型的機制。方法：由高脂飲食誘導建立高血壓痰濕壅盛證大鼠模型，與普通Wistar大鼠對照，觀察兩組大鼠一般生理情況，應用酶聯免疫法（ELISA）檢測大鼠血清中的甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、超氧化物歧化酶（SOD）、血管加壓素（AVP）及血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）等變化，光鏡觀察腎組織和脂肪組織的形態結構，實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測腎臟AT1R、AT2R和AQP2的mRNA和蛋白的表達。結果：與正常對照組比較，模型組大鼠血中TG、TC、AVP、AngⅡ均明顯升高（P＜0.05），模型組大鼠腎臟AT1R、AQP2的mRNA和蛋白表達上調（P＜0.05），AT2RmRNA和蛋白表達下降（P＜0.05）。結論：飲食誘導高血壓痰濕壅盛型大鼠腎臟存在水鈉潴留的病理機制。

痰濕壅盛型 水鈉潴留 大鼠腎臟 高血壓

隨著現代人生活方式的改變，肥胖性高血壓逐漸成為臨床常見病、多發病。中醫學中，高血壓病屬于“眩暈”、“頭痛”范疇，肥胖患者屬于痰濕體質，如南宋醫家楊士瀛《仁齋直指方論》中有言：“肥人氣虛生寒，寒生濕，濕生痰。”本病多由飲食不節、勞逸失度，導致臟腑功能失調，水液代謝失常、聚濕生痰，痰濁中阻，清陽不升，發為眩暈，為眩暈痰濕壅盛證[1]。本研究通過高脂飲食誘導建立高血壓痰濕壅盛證大鼠模型，探求腎臟水鈉潴留在痰濕壅盛證高血壓疾病發生發展過程中的病理生理學基礎，為高血壓痰濕壅盛證的中醫病證結合動物模型的研究提供分子生物學基礎和客觀實驗數據支撐。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組

SPF級8周齡雄性Wistar大鼠60只，體質量約180±15 g，濟寧魯抗集團提供[動物合格證：scxk(魯)2013-0001]；由標準化飼養籠子喂養。大鼠適應性喂養1周后，按體重隨機分為正常對照組（n=10）和實驗組（n=50）。對照組喂以常規基礎飼料。實驗組給予高脂飲食16周，從中選取體重、血壓均超過對照組平均值25%者作為模型組，實驗組大鼠共19只納入實驗模型組，其余淘汰大鼠過量麻醉處死。基礎飼料由濟寧魯抗集團提供，其配方為：玉米30%、小麥31%、豆粕20.8%、麥麩10%、魚粉6%、酵母粉1%、骨粉1%、鹽0.02%、多維素0.02%、魚肝油0.01%。高脂高營養飼料配方：普通飼料60%、豬油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生粉5%、雞蛋10%、麻油1%、食鹽2%，自購原材料，由濟寧魯抗集團加工制作[2]。

1.2 主要實驗儀器與試劑

Axiovert 40型倒置相差顯微鏡（德國蔡司公司產品）；Arktik Thermal Cycler 96孔型PCR儀（美國Thermo Scientific公司）；LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀（美國Roche集團產品）；NanoDrop2000微量紫外可見分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；Mini-Protean Tetra電泳系統(美國Thermo Scientific公司)； Fluor Chem Q成像分析系統(美國Alpha Innotech公司)。

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）ELISA檢測試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司，批號：A25364-09）、血管加壓素（AVP）ELISA檢測試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司，批號：10717R），微球蛋白（β2-MG）ELISA檢測試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司，批 號：B52136-09）；Trizol（美 國Amresco公 司，批號：E174）；逆轉錄試劑盒（大連TaKaRa公司，批號：RR047A）；PCR（美國羅氏診斷試劑公司，批號：10559520）；兔抗大鼠血管緊張素Ⅱ 1型受體（AT1）多克隆抗體（北京博奧森公司，批號：bs-0630R）、兔抗大鼠水通道蛋白2（AQP2）多克隆抗體（北京博奧森公司，批號：bs-5187R）、免疫組化染色試劑盒（北京博奧森公司，批號：SP-0023）；DAB顯色試劑盒（北京中衫公司，批號：ZLI-9031）；PIPA裂解液（碧云天生物技術研究所，批號：P0038B）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：PC0020）；羊抗兔多克隆抗體（北京中衫金橋生物技術有限公司，批號：ZB-2301）；ECL化學發光試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：P0018）；委托山東省中醫院檢驗科代為檢測甘油三酯（Total Glyceride，TG）、膽固醇（Total Cholesterol，TC）。

1.3 樣品收集與指標測定

各組大鼠每周用尾套法測定大鼠血壓，并監測體質量。造模前，各組大鼠禁食不禁水16 h，3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1體質量）腹腔注射麻醉，尾靜脈取血，檢測血脂水平。16周末，3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1體質量）腹腔注射麻醉大鼠，下腔靜脈取血，分離血清，進行血脂含量測定，應用酶聯免疫法檢測大鼠血清中AVP、AngⅡ、SOD及β2-MG等變化。處死大鼠，取大鼠左腎組織保存于4%多聚甲醛液中，用于常規病理觀察，右腎放入-70℃冰箱保存。

1.4 脂肪組織及腎組織病理檢查

第16周末，于實驗大鼠腹部大網膜下取脂肪組織，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟浸蠟。同步處理完后將脂肪組織再移至杯中進入 65℃恒溫箱中繼續浸蠟2-3 h。摘除大鼠腎臟，去除包膜，沿長軸切開。4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片。切片厚度4 μm，蘇木素-伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，脫水，透明，中性樹膠封片，普通光學顯微鏡下觀察腎臟組織的形態學改變。

1.5 免疫組織化學法觀察

AQP2和AT1R左腎石蠟包埋，切片厚度4 μm，常規脫蠟，3%的H2O2室溫10 min 消除內源性過氧化物酶，5% BSA 室溫封閉30 min，滴加兔抗大鼠AQP2和AT1R一抗（1∶200 倍稀釋），濕盒內4℃孵育過夜，PBS洗5 min×5次，滴加羊抗兔IgG二抗，室溫孵育60 min，PBS洗5 min×5次，滴加SABC，室溫30 min，PBS漂洗，DAB顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木素復染，脫水透明中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照，以棕黃色顆粒沉積者判定為陽性。

1.6 實時熒光定量PCR

AQP2、AT1R和AT2R引物由上海生工生物合成股份有限公司合成。建立20 μL PCR反應體系：2×Master Mix 10.0 μL、水6.0 μL、引物2.0 μL、cDNA 2.0 μL。Real-time PCR反應條件為：95℃預變性5 s；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，擴增45個循環；95℃變性5 s，65℃延伸60 s，97℃酶瞬間滅活；40℃冷卻10 s。數據采用2-ΔΔCt法分析，通過2-ΔΔCt直接計算出模型組與對照組間對應基因的表達差異[3,4]。

1.7 蛋白免疫熒光印跡法實驗

右腎以PIPA裂解液提取組織蛋白。12%SDSPAGE電泳，上樣量為50 μg，電轉印至PVDF膜，5%脫脂奶的PBS-T室溫封閉1 h。棄封閉液，不洗，加入適當稀釋度的相應一抗（兔抗大鼠AQP2,兔抗大鼠AT1R、兔抗大鼠AT2R，均1∶300稀釋），以β-actin為內參，4℃孵育過夜。次日1×PBS-T洗滌5 min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗（1：20 000）室溫孵育1 h，1×PBS-T洗滌5 min×5次。ECL顯色，Fluor Chem Q下曝光，條帶進行半定量分析。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 造模前兩組大鼠血壓及血脂水平比較

高脂飼料飲食誘導前，兩組大鼠血壓、血脂水平比較，差異無統計學意義（見表2）。

2.2 造模后大鼠的一般狀況與證候表現

與正常對照組相比，模型組大鼠造模初始階段，食欲相對降低，可能是由于大鼠不適應高脂飼料的原因，約4周左右，模型組大鼠飲食量增加，飲水量、尿量增加。出現體型肥胖，腹部松軟下垂，倦怠懶動，瞇眼，皮毛干枯色黃，毛發疏松、蓬亂無光，爪色、耳色淡白，糞便稀軟，且臭穢。與正常對照組相比，模型組大鼠24 h尿量增加，（8.10±4.91v. s.2.34±1.82）mL，P＜0.05。

2.3 大鼠血壓及體重變化

如圖1所示，與對照組相比，模型組大鼠體重、血壓隨時間變化均明顯升高，P＜0.05。模型成功率為38%。

2.4 大鼠血脂水平及血清學比較

喂食高脂飼料16周后，大鼠靜脈血清測得結果比較，與對照組相比，模型組大鼠血中TG、TC明顯升高，P＜0.05；與對照組相比，模型組大鼠AngⅡ、AVP、β2-MG升高，SOD 降低，P＜0.05（見表3、表4）。

表1 引物序列

表2 造模前大鼠血壓血脂水平比較（）

表2 造模前大鼠血壓血脂水平比較（）

注：兩組大鼠喂養前血壓、血脂水平無統計學差異，P＞0.05。

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圖1 大鼠體重、血壓變化

2.5 腎臟及脂肪組織病理改變

模型組大鼠腎臟部分腎小球高度擴張，腎小球毛細血管擴張，球囊間隙增寬，個別腎小球變性壞死萎縮，部分腎小管擴張，動脈血管內皮增生、玻璃樣變和空泡變性，管壁內蛋白分泌（蛋白管型）。

表3 喂食高脂飼料后兩組大鼠血中TG、TC濃度變化（）

表3 喂食高脂飼料后兩組大鼠血中TG、TC濃度變化（）

注：與對照組比較，模型組血脂水平升高，*P＜0.05。

表4 喂食高脂飼料后兩組大鼠血清中AngⅡ、AVP、β2-MG、SOD濃度變化（）

表4 喂食高脂飼料后兩組大鼠血清中AngⅡ、AVP、β2-MG、SOD濃度變化（）

注：與對照組比較，模型組AngⅡ、AVP、β2-MG升高，SOD降低，*P＜0.05。

與對照組相比，模型組大鼠脂肪細胞明顯變大，脂肪組織間隙可見有炎性細胞浸潤（見圖2）。

圖2 腎臟及脂肪組織HE染色結果（×200）

2.6 免疫組織化學結果

由圖3可知，本實驗中大鼠腎臟AT1R蛋白分布在腎小球內，AQP2蛋白分布集中在血管周圍，與對照組大鼠相比，模型組大鼠AT1R和AQP2蛋白表達增加。

2.7 大鼠腎臟AT1R、AT2R及AQP2的mRNA表達

與對照組相比，模型組腎臟中的AT1R、AQP2 的mRNA表達顯著上調，*P＜0.05，AT2R的mRNA表達下降，*P＜0.05，見圖4。

2.8 大鼠腎臟AT1R、AT2R及AQP2的蛋白表達

與對照組相比，模型組腎臟中的AT1R、AQP2蛋白表達顯著上調，*P＜0.05，AT2R蛋白表達下降，*P＜0.05。

3 討論

清·吳謙曰:“痰者，水谷之津液不能四布，留于胸中而成者也”。可見痰濕成因不外有二：飲食不節，過食肥甘；臟腑失調，水液運化失司。中醫認為：腎為先天之本，有主持和調節人體水液代謝的功能，《素問·上古天真論》“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，《景岳全書·腫脹》篇曰：“蓋水為至陰，故其本在腎。”腎虛氣化不利，水濕不運，停聚成痰濕。由此可見，痰濕的生成與腎臟水鈉潴留有密切關系。現代醫學認為，腎臟為人體水、電解質代謝的主要器官，腎臟排出尿量與電解質量在維持細胞滲透壓、調節機體內環境的平衡中占據重要作用。因此，本文通過建立高血壓痰濕壅盛證大鼠模型，觀察大鼠腎臟水鈉潴留的程度，探討水鈉潴留機制在高血壓痰濕壅盛證疾病發生發展中的作用及其機制。

圖3 腎臟AT1R和AQP2的表達分布（×200）

圖4 大鼠腎臟AT1R、AT2R及AQP2的mRNA表達

圖5 大鼠腎臟AT1R、AT2R及AQP2的蛋白表達

孫健龍等[5]給實驗大鼠以高脂飼料，引起實驗大鼠體重增加、血脂增高，建立脾虛痰濕壅盛大鼠模型。本實驗結合上述動物模型制作方法，略有改進，用高脂飼料誘導制作高血壓痰濕壅盛證大鼠模型。本研究中，造模前大鼠血脂、血壓及體重無差異（P＞0.05）。高脂飲食16周后，模型組大鼠出現體型肥胖，腹部松軟下垂，倦怠懶動，皮毛干枯，毛發疏松、蓬亂無光，爪色、耳色淡白、糞便稀軟等癥狀復合中醫痰濕壅盛的癥狀表現，且體重增加，血壓升高，血清血脂水平明顯增加（P＜0.05），脂肪組織病理顯示：脂肪細胞增大。這說明長期高脂飲食成功誘導了高血壓痰濕壅盛證大鼠模型。

腎臟是負責人體尿鈉排泄的重要器官，腎臟通過調節細胞外液量來維持人體血壓長期穩態。肥胖時，機體存在的炎癥、氧化應激、脂肪因子改變、胰島素抵抗等病理生理改變，導致腎臟損傷[6]。腎臟局部的脂代謝改變進一步加重腎臟氧化應激[7]。氧化應激可以使腎臟局部的RAS激活[8]。AngⅡ是RAS系統中的主要活性肽，主要作用于AT1受體和AT2受體。按照利尿、排鈉的作用分類，具有保鈉和潴水作用的受體是AT1R，其利鈉、排尿作用的受體為AT2R，兩種受體相互作用、控制尿鈉排泄在適當的范圍內，從而保持血容量的平衡及血壓穩態[9]。本研究中，同對照組比較，模型組大鼠循環水平的AngⅡ升高，抗氧化物質SOD減少，腎臟AT1R的mRNA和蛋白表達的水平升高，AT2R的mRNA和蛋白表達下降，說明肥胖大鼠腎臟氧化應激損傷激活腎臟局部RAS系統，導致醛固酮分泌增多，造成水鈉潴留，血壓升高。

β2微球蛋白是體內有核細胞產生的一種小分子球蛋白，當腎小球濾過功能受損或濾過負荷增加時，外周血中β2微球蛋白升高，是反映早期高血壓腎功能損傷的良好指標[10]。腎臟局部產生的AngⅡ通過調節腎小球濾過、腎小管重吸收及系膜細胞的增殖、收縮等功能，升高血管內壓力從而直接影響腎血流動力學加重腎臟病理性改變[11]。同時AngⅡ與AT1R結合后，直接改變腎小球基膜的通透性，促進平滑肌細胞肥厚增生，系膜外基質合成，加速腎小球硬化[12]。本研究中，模型組大鼠在循環及局部RAS激活的情況下，出現腎臟損害，血清中的β2-MG升高，腎小球濾過功能的下降又進一步加重水鈉潴留和血壓升高。此結果與朱賢惠研究結果相似[13]。

血管加壓素是一種主要由下丘腦視上核和室旁核等分泌的神經多肽，是調節水液代謝的重要物質[14]。AVP與其受體結合后發揮生理作用，包括Vl受體和V2受體2種[15]。其中V2受體又稱為腎臟受體，可促進水的再吸收，起抗利尿作用。AVP升高時，舒張壓升高。水通道蛋白（AQP）是廣泛存在的一種與水轉運有關的細胞膜轉運蛋白[10]。水通道蛋白2（Aquaporin 2，AQP2）位于腎臟集合管主細胞管腔側和靠近管腔側的囊泡內，是AVP依賴性水通道，是調節腎臟集合管對水通透性的關鍵蛋白，在調節腎臟水平衡中起重要作用，并被認為是維持體內水平衡的必須物質[16]。AVP通過V2受體對AQP2進行調節。AVP長期作用的情況下，AQP2不僅通過穿梭機制使AQP2開放增多，而且AQP2 本身合成明顯增加，表現為mRNA與蛋白分子表達顯著增強，此變化與AVP水平呈正相關。近年來的研究證明，AVP的釋放除了受到血液滲透性因素調節外，多種非滲透性因素可以使其異常升高。AngⅡ是促使AVP釋放的一個重要因素[17]。本實驗中，模型組鼠循環水平的AVP顯著提高，腎臟AQP2mRNA和蛋白表達升高，說明模型組大鼠AVP系統激活，模型組大鼠水潴留增加，舒張壓升高，平均動脈壓升高，血壓上升。

痰濕壅盛證高血壓大鼠水鈉潴留的機制非常復雜，本研究發現腎臟局部氧化應激損傷導致腎臟局部RAS系統激活，大鼠的AVP系統激活是否與氧化應激存在相關性，有待進一步實驗研究。

1 王淑玲,孫秀梅,張兆旺,等.半夏白術天麻湯4種提取液對高血壓痰濕壅盛型大鼠的影響.中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(18)∶179-182.

2 孫志,張中成,劉志誠.營養性肥胖動物模型的實驗研究.中國藥理學通報, 2002, 18(4)∶ 466-467.

3 Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signaling cascades. Nature, 2001, 410 (6824)∶ 37-40.

4 Yamamoto K, Hamada H, Shinkai H, et al. The KDEL receptor modulates the endoplasmic reticulum stress response through mitogenactivated protein kinase signaling cascades. J Biol Chem, 2003, 278(36)∶ 34525-34532.

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13 朱賢惠.早期腎臟損害標志物與高血壓病中醫辨證分型的臨床相關性.遼寧中醫藥大學學報, 2010, 12(2)∶ 96-98.

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Mechanism of Water-Sodium Retention of Hypertensive Rats with Abundant Accumulation of Phlegm and Dampness Syndrome

Meng Xianqing1, 2, Yang Chuanhua2, Wu Sai1, Jiang Yuehua2, Wu Bo2
(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250011, China)

The study was aimed to investigate the mechanism of water-sodium retention of obesity-related hypertensive rats with abundant accumulation of phlegm and dampness syndrome. Obesity-related hypertensive rats with abundant accumulation of phlegm and dampness syndrome, which referred to the model group, were induced by high-fat diet. Levels of tri glyceride (TG), total cholesterol (TC), superoxide dismutase (SOD), vasopressin (AVP) and angiotensinⅡ (AngⅡ ) in serum were detected by the enzyme linked immunosorbent assays (ELISA). The morphological structures of renal and adipose tissues were observed by light microscope. The mRNA and protein expressions of AT1R, AT2R and AQP2 in kidney were examined by real-time polymerase chain reaction (PCR) and western blot. The results showed that compared with the normal control group, serum TG, TC, AVP and Ang Ⅱ in the model group increased significantly (P ＜ 0.05), and mRNA and protein expressions of AT1R and AQP2 in kidney was up regulated (P ＜ 0.05). The mRNA and protein expressions of AT2R were decreased (P ＜ 0.05). It was concluded that water and sodium retention took part in the kidney injury of obese hypertensive rats, which m ay be one of the important mechanisms in obesity-related hypertension.

Abundant accumulation of phlegm and dampness syndrome, water and sodium retention, kidney of rats, hypertension

10.11842/wst.2016.02.022

R228

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-09-09

修回日期：2015-10-23

＊ 山東省委組織部泰山學者崗位建設資金項目（2014GSF119011）：負責人：楊傳華；山東省自然科學基金委聯合專項（ZR2014HL096）：從瘦素介導的下丘腦JAK/STAT3信號轉導探討刺蒺藜改善肥胖性高血壓的作用機制，負責人：吳波。

＊＊ 通訊作者：楊傳華，二級教授，主任醫師，泰山學者，主要研究方向：中醫心系疾病。